(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810665123.5
(22)申请日 2018.06.25
(71)申请人 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司
地址 314000 浙江省嘉兴市南湖区昌盛南
路501号浙江欧美生物科技产业园2幢
3层101室
(72)发明人 夏文豪 陈贤情 蒿飞 杨月
王筱 王文
(74)专利代理机构 北京华仲龙腾专利代理事务
所(普通合伙) 11548
代理人 李静
(51)Int.Cl.
C12N 15/70(2006.01)
C12P 19/02(2006.01)
(54)发明名称一种在大肠杆菌中利用果糖合成D-塔格糖的方法(57)摘要本发明涉及一种在大肠杆菌中利用果糖合成D-塔格糖的方法，步骤如下：1)将FbaA的密码子以及基因HXK的密码子构建在质粒pET28a上，得到重组质粒1，重组质粒1上带有大肠杆菌的卡那霉素抗性基因；2)将根据大肠杆菌密码子偏好性 优化基因appA的密码子构建在质粒pET22b上，得到重组质粒2，重组质粒上带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性基因；3)敲除大肠杆菌中的T6P的糖磷酸转运蛋白UhpT，得到ΔUhpT的大肠杆菌的菌株；4)将上述重组质粒1和重组质粒2同时转入经过改造的菌株中，根据卡那霉素抗性基因和氨苄霉素抗性基因筛选阳性克隆，得到最终的发酵菌株；5)全细胞催化合成塔格糖。本发明在微生物体内进行生物酶的催化合成，生产成本和对环境
友好方面容易控制。
权利要求书1页 说明书3页序列表5页 附图3页CN 108795962 A 2018.11.13
C N 108795962
A
1.一种在大肠杆菌中利用果糖合成D -塔格糖的方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
1)将根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因FbaA的密码子以及基因HXK的密码子构建在质粒pET28a上，得到重组质粒1，重组质粒1pET28a -HXK&FbaAs上带有大肠杆菌的卡那霉素抗性基因；
2)将根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因appA的密码子构建在质粒pET22b上，得到重组质粒2，重组质粒2pET22b -appA上带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性基因；
3)敲除大肠杆菌中的T6P的糖磷酸转运蛋白UhpT，得到ΔUhpT的大肠杆菌的菌株Taga -ΔUhpT；
4)将上述重组质粒1和重组质粒2同时转入经过改造的Taga -ΔUhpT菌株中，根据卡那霉素抗性基因和氨苄霉素抗性基因筛选阳性克隆，然后提取大肠杆菌的质粒进行PCR验证，得到最终的发酵菌株Taga -ΔUhpT -HXK -FbaA -appA；
5)基于步骤4)发酵菌株Taga -ΔUhpT -HXK -FbaA -appA进行全细胞催化合成塔格糖。
2.根据权利要求1所述的在大肠杆菌中利用果糖合成D -塔格糖的方法，其特征在于：步骤5)中全细胞催化合成塔格糖的具体操作如下：
51)在添加了相应抗性的LB液体培养基中，隔夜培养发酵菌株，使构建好的发酵菌株活化；
52)将上一步活化后的发酵菌株转接至添加了相应抗性的LB液体培养基中，培养至OD600≥1；
53)将上一步中的菌液按1％的接种量转入2YT培养基中，培养至OD600＝0.7-1.0；
54)加入异丙基-β-D -硫代半乳糖苷诱导，培养16h -18h，培养温度为16-18℃，220-250rpm，然后发酵液冷却至4℃，4200-5000rpm收集菌液；
55)将收集的菌液用磷酸盐buffer悬浮，进行20倍的浓缩；
56)添加相应的底物果糖，37-39℃，220-250rpm反应24-36h，收集产生的D -塔格糖。
3.根据权利要求2所述的在大肠杆菌中利用果糖合成D -塔格糖的方法，其特征在于：步骤51)和52)中，LB培养基的质量分数组成为：1％的胰化蛋白胨，0.5％的酵母抽提物，1％的NaCl，用NaOH调pH值至7.5，121℃灭菌20min备用。
4.根据权利要求3所述的在大肠杆菌中利用果糖合成D -塔格糖的方法，其特征在于：步骤51)和52)中培养温度37-39℃，转速210-230rpm。
5.根据权利要求2所述的在大肠杆菌中利用果糖合成D -塔格糖的方法，其特征在于：2YT培养基的质量分数组成为：1.6％的胰化蛋白胨，1％的酵母抽提物，0.5％的NaCl，121℃灭菌20min备用。
6.根据权利要求5所述的在大肠杆菌中利用果糖合成D -塔格糖的方法，其特征在于：步骤53)中培养温度37-39℃，转速210-230rpm。
权 利 要 求 书1/1页CN 108795962 A
一种在大肠杆菌中利用果糖合成D-塔格糖的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种在大肠杆菌中利用果糖合成D-塔格糖的方法，属于合 成生物学领域。
背景技术
[0002]稀少糖(Rare Sugar)是自然界中存在但含量极少的一类单糖(糖的最 小单位)和糖醇，和自然界大量存在的葡萄糖和果糖相比，非常稀少，约 有50个种类。其味类似于蔗糖，但具有热量低、稳定性高、甜味协调、无 吸湿性、无致龋齿性、耐受性高等优点，可以弥补传统甜味剂的不足，被 广泛应用于保健食品、婴幼儿配方食品，乳制品，饮料等食品中，尤其对 改善特殊人的饮食起到重要作用。稀少糖的益处还有很多，例如可以减 少有毒物质(如内毒素、氨类等)的形成，对肠粘膜细胞和肝具有保护作 用，可以调节肠道菌，让某些微生物定植于肠道，并为其提供适宜的栖 息环境，促进肠黏膜免疫功能的完善和影响、参与人体的多种代谢功能， 从而防止病变肠癌的发生，增强机体免疫力。 [0003]D-塔格糖是稀少糖的一种，近年被发现的一种具有特殊保健功能的功能 甜味剂，其甜度与蔗糖相似，而产生的热量只为蔗糖的1/3，所以被称之为 低热量甜味剂，具有能量低，可改善肠道菌，降低血糖，抗龋齿等功 能。2001年被美国食品与药物管理局(U.S.Food and Drug Administration， FDA)确定为普遍公认安全食品(GRAS)。随后D-塔格糖在美国被通用于 健康饮料及酸乳、果汁等产品，作为蔗糖的代用品。同时还被广泛应用于 糖尿病专用食品、减肥食品、口香糖、谷物食品、饮料、肉制品、糖果等 工业中，并在医药中被用于咳嗽糖浆、粉剂、起泡剂、固定假牙的豁合剂 及口腔消毒剂中。目前D-
塔格糖在国际市场上的市场份额正逐年增加，国 内市场还正在发展，由于中国人口基数大，糖尿病患者高居世界首位，功 能性甜味剂市场广阔等，D-塔格糖在中国市场上具有极大的潜力。[0004]目前，D-塔格糖的合成方法主要是化学催化合成法和生物转化法，化学 催化合成法是以半乳糖为原材料，通过金属氢氧化合物(常为Ca(OH)2) 以及碱金属催化剂(常为CaCl2)催化半乳糖生成D-塔格糖-Ca复合物，再 通过酸中和将塔格糖从复合物中释放出来，该方法具有原材料较贵、产生 化学污染物、碱性条件副产物多、分离困难等诸多缺点。而生物转化法是 通过L-阿拉伯糖异构酶将半乳糖转化为塔格糖，但同样该反应具有原材料 较贵、转化效率低、产物分离难度大等缺点，很难实现工业化大规模生产。
发明内容
[0005]本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种利用大肠杆菌从果 糖高效合成塔格糖的生物合成方法，该方法转化效率高、无污染、生产周 期短、成本低、可持续生产及环境友好。
[0006]本发明的目的通过一下技术方案实现，具体路线见说明书附图1。
[0007]D-塔格糖的生物合成工艺路线是以果糖为原料，经过HXK、FbaA和 appA生物酶的催化作用合成D-塔格糖见附图1，全过程在发酵罐中进行， 对环境友好，无污染。
[0008]在大肠杆菌中利用果糖合成塔格糖，具体过程如下：
[0009]1)将根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因FbaA的密码子以及基因 HXK的密码子，这两个基因的密码子构建在质粒pET28a上，得到重组 质粒1，重组质粒1：pET28a-HXK& FbaAs上带有大肠杆菌的卡那霉素 抗性基因，见附图1；
[0010]2)将根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因appA(肌醇六磷酸酶) 的密码子构建在质粒pET22b上，得到重组质粒2，重组质粒2： pET22b-appA上带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性基因，见附图2；
[0011]3)敲除大肠杆菌中的T6P的糖磷酸转运蛋白(UhpT)，得到ΔUhpT 的大肠杆菌的菌株Taga-ΔUhpT；
[0012]4)将上述重组质粒1和重组质粒2同时转入经过改造的Taga-ΔUhpT 菌株中，根据卡那霉素抗性基因和氨苄霉素抗性基因筛选阳性克隆，然后 提取大肠杆菌的质粒进行PCR 验证，得到最终的发酵菌株 Taga-ΔUhpT-HXK-FbaA-appA；
[0013]5)基于步骤4)发酵菌株Taga-ΔUhpT-HXK-FbaA-appA进行全细胞催 化合成塔格糖。
[0014]本专利用到的物种及基因见下表1。
[0015]表1专利中用到的物种
[0016]
[0017]
[0018]本发明在大肠杆菌中通过三步酶法实现了果糖到D-塔格糖的高效生产， 与上述合成方法的不同之处在于：
[0019]1)以果糖为原材料，工艺原材料成本低；
[0020]2)以改造微生物为技术基础，在微生物体内进行生物酶的催化合 成，避免大规模的提取、分离、纯化过程，从生产成本和对环境友 好方面容易控制。
[0021]3)本工艺仅在生产的最后步骤有分离纯化工序，产品纯化工艺简 单，产品质量比一般方法纯度更好、含量更高。
[0022]4)合成过程没有废液排放，环境友好，无污染，可持续生产，本发 明工艺从经济、环境和职业健康角度均为优良的工业化生产指路线。
附图说明
[0023]图1本发明的D-塔格糖合成路线图。
[0024]图2本发明中用到的质粒pET28a-HXK&FbaAs的质粒图谱。
[0025]图3本发明中用到的质粒pET22b-appA的质粒图谱。
具体实施方式
[0026]以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明， 并非用于限
定本发明的范围。
[0027]实施例1质粒构建方法。
[0028]本专利根究相应基因的氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏好性，优化出 基因的核酸序列，送商业基因合成公司将基因合成，根据FbaA、HXK和 appA的基因序列，按照附图2中的质粒图谱构建质粒pET28a-HXK&FbaAs， 按照附图3中的质粒图谱构建质粒pET22b-appA。质粒Pet28a-HXK&FbaAs 中两个基因共用一个T7启动子，在质粒上基因末尾段添加6×histag基因序 列(CATCATCATCATCATCAT)，基因之间用RBS序列(AAGGAG)连接。 相应片段间设计20bp左右大小的同源臂，片段与片段之间用商业试剂盒 (一步克隆试剂盒)连接，转化进入大肠杆菌细胞，在相应抗性平板上挑 取单克隆进行验证，验证正确的质粒，转化进入表达细胞中，后续进行诱 导表达。
[0029]实施例2全细胞催化
[0030]全细胞催化是利用完整的生物有机体作为催化剂进行化学转化，即利 用细胞内的酶进行催化。在本实验中通过在LB培养基中过夜培养构建好 的发酵菌株Taga-ΔUhpT-HXK-FbaA-appA，活化后的菌液再转20mL的LB 培养液中培养带其OD达到预定值转入2YT培养基中培养，当OD达到0.8 时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导外源目的基因的表达。诱导 表达后收集菌液在磷酸盐中浓缩后添加底物进行反应，最后收集目的产物 D-塔格糖。
[0031]全细胞催化过程如下：
[0032]1)37℃，220rpm，在添加了相应抗性的LB培养基中，隔夜培养细胞 大肠杆菌，使构建好的目的
菌株活化；
[0033]2)转接20mL，37℃，220rpm，添加了相应抗性的LB培养基中，培养 至OD600＝1左右；[0034]3)将上一步中的菌液按1％的接种量转入800mL大瓶2YT培养基中， 37℃，220rpm 培养至OD600＝0.8左右。
[0035]4)培养温度为16℃，220rpm，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱 导，培养16h-18h后，4℃，4200rpm收集菌液。
[0036]5)将收集的菌液用磷酸盐buffer悬浮，进行20倍的浓缩。
[0037]6)添加相应的底物，37℃，220rpm反应24h，通过高效液相谱(HPLC) 检测生成的D-塔格糖含量。
[0038]注：LB(Luria-Bertani)培养基：
[0039]1％的胰化蛋白胨，0.5％的酵母抽提物，1％的NaCl，用NaOH调pH值至 7.5，121℃灭菌20min备用。其中固体LB培养基在LB液体培养基中加入 1.5％的琼脂粉。
[0040]2YT培养基：
[0041] 1.6％的胰化蛋白胨，1％的酵母抽提物，0.5％的NaCl，121℃灭菌20min 备用。所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是在本发 明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应在本发 明的保护范围之列。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议