[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1414019A [43]公开日2003年4月30日
[21]申请号02136493.1[21]申请号02136493.1
[22]申请日2002.08.14[71]申请人上海天伟生物制药有限公司
地址201108上海市莘庄工业区申强路588号
[72]发明人梅民权 郑扶桑 [74]专利代理机构上海智力专利事务所代理人瞿承达
[51]Int.CI 7C07K 14/59C07K 14/435C07K 14/47
权利要求书 1 页 说明书 4 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明公开了一种生产高纯度的绝经后尿促性
的尿促卵泡素和高纯度的人尿黄体生成素，先溶解
在合适的缓冲液或无热源水中，溶解用缓冲液，pH
值为4.0～10.0，含有碱性金属离子如钾、钠离子
等，或含有铵根离子，也可以是稀酸溶液，如稀磷
酸、稀盐酸或稀醋酸等，然后将得到的溶液，用有
机溶剂沉淀后真空干燥或直接冷冻干燥，干燥方法
可以是丙酮、乙醇等有机溶剂沉淀溶液中的蛋白质，
然后真空干燥获得干物质，也可以直接冷冻干燥或
用超滤等方法浓缩脱盐后冻干，即得到高纯度的绝
经后尿促性腺素。
02136493.1权 利 要 求 书第1/1页
1.一种生产高纯度的绝经后尿促性腺素的方法，其特征是：
(a)根据需要的尿促卵泡素和人尿黄体生成素的比例分别称取适量的高纯度的尿促卵泡素和高纯度的人尿黄体生成素， (b)将高纯度的尿促卵泡素和高纯度的人尿黄体生成素溶解在合适的缓冲液或无热源水中，然后将得到的溶液，用有机溶剂沉淀后真空干燥或直接冷冻干燥，即得到高纯度的绝经后尿促性腺素。
2.根据权利要求1所述的一种生产高纯度的绝经后尿促性腺素的方法，其特征在于所述的高纯度的尿促卵泡素是指尿促卵泡素生物效价大于8000IU/mg、来源于绝经后妇女尿液的尿促卵泡素蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种生产高纯度的绝经后尿促性腺素的方法，其特征在于所述的高纯度的入尿黄体生成素是指人尿黄体生成素生物效价大于5000IU/mg、来源于绝经后妇女尿液的黄体生成素蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种生产高纯度的绝经后尿促性腺素的方法，其特征在于所述的高纯度的绝经后尿促性腺素，是指尿促卵泡素效价大于4000IU/mg，尿促卵泡素与人尿黄体生成素之比例为1∶1、2∶1、3∶1或其他需要的特定比例。
5.根据权利要求1所述的一种生产高纯度的绝经后尿促性腺素的方法，其特征在于所述的溶解用缓冲液，pH值为4.0～10.0，含有碱性金属离子如钾、钠离子等，或含有铵根离子。也可以是稀酸溶液，如稀磷酸、稀盐酸或稀醋酸等。
6.根据权利要求1所述的一种生产高纯度的绝经后尿促性腺素的方法，其特征在于所述的干燥方法，可以是丙酮、乙醇等有机溶剂沉淀溶液中的蛋白质，然后真空干燥获得干物质，也可以直接冷冻干燥或用超滤等方法浓缩脱盐后冻干。
7.根据权利要求1所述的用一种生产高纯度的绝经后尿促性腺素的方法，其特征在于所述的按以上方法获得的高纯度绝经后尿促性腺素蛋白，可以按照已知的方法制成冻干制剂，制剂含有适当的赋形剂，可以是甘露醇、乳糖、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖或它们的混合物，也可含有适当的保护剂，如人血白蛋白。
02136493.1说 明 书第1/4页一种生产高纯度的绝经后尿促性腺素的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产高纯度的绝经后尿促性腺素的方法。 背景技术：
经研究证明，发达国家约有15～20％的夫妇不能生育，其中三分之一不育症的病因归结于排卵功能障碍(无排卵或黄体功能不健全)，通过补充外源性促性腺素可以有效诱导排卵。 绝经后尿促性腺素是由绝经后妇女尿液中提取的人体内源性促性腺素，其活性成分为尿促卵泡素和人尿黄体生成素，这两种激素对卵泡的生长起决定性作用。一个卵泡从开始发育到成熟大约需要85天，排卵前一周期的黄体期，尿促卵泡素可以促使颗粒细胞(GC)生长和增殖，并刺激雌激素分泌，人尿黄体生成素则刺激髓鞘细胞合成雄激素；卵泡中晚期，人尿黄体生成素和尿促卵泡素协同维持卵泡发育，并为月经中期人尿黄体生成素峰准备；排卵前人尿黄体生成素峰通过阻断丘内GC的缝隙连接，诱导卵母细胞完成第一次减数分裂，引起卵泡破裂和GC黄体化。
排卵功能障碍的不育妇女使用绝经后尿促性腺素制剂，可以促使并维持卵泡的发育和成熟，使卵泡发育和受孕达到最佳效果。但由于不同病人的内源性人尿黄体生成素水平有所不同，临床上需要尿促卵泡素与人尿黄体生成素比例不同的制剂，对症下药。
意大利Serono公司于1960年首先推出尿促卵泡素与人尿黄体生成素LH之比为1∶1的绝经后尿促性腺素，该品种后来被美国、英国和中国药典收载。日本等国则有尿促卵泡素与人尿黄体生成素比例为2∶1或3∶1
的绝经后尿促性腺素制剂产品。所有这些绝经后尿促性腺素产品，尿促卵泡素效价只有60～150I U/m g，纯度不到1％，含有大量尿源性的杂蛋白。 传统的绝经后尿促性腺素生产方法是以1IU/mg左右的绝经后尿促性腺素粗品为原料，同时纯化尿促卵泡素和人尿黄体生成素。由于两者的理化性质有很大不同，纯化过程中很难保证尿促
卵泡素和人尿黄体生成素的比例恒定，对比例要求不同的产品，必需采用不同的方法。为了保证成品中尿促卵泡素和人尿黄体生成素的比例，最终产品往往需要添加生物活性与人尿黄体生成素类似的绒促性素(HCG)进行调整。按照传统方法，几乎不可能获得纯度高、比例又合适的高纯度绝经后尿促性腺素产品。 发明内容：
本发明的目的是用从绝经后妇女尿液中提取的高纯度尿促卵泡素和人尿黄体生成素，生产高纯度绝经后尿促性腺素。 为了实现上述的目的本发明的解决方法是：本发明的原料为绝经后健康妇女尿液中提取的高纯度尿促卵泡素蛋白和高纯度人尿黄体生成素蛋白，高纯度尿促卵泡素是指尿促卵泡素生物效价大于8000IU/mg，高纯度人尿黄体生成素是指人尿黄体生成素生物效价大于5000IU/mg，先根据需要的尿促卵泡素与人尿黄体生成素的比例和高纯度尿促卵泡素、人尿黄体生成素的生物效价，计算所需高纯度的尿促卵泡素和人尿黄体生成素的重量，按计算结果分别称取高纯度尿促卵泡素、人尿黄体生成素，并先后溶解于合适的缓冲液或无热源水中，缓冲液pH值为4.0～10.0，含有碱性金属离子如钾、钠离子等，或含有铵根离子。也可以是稀酸溶液，如稀磷酸、稀盐酸或稀醋酸，搅拌使蛋白溶解充分，溶解充
分后的溶液，用适宜的方法干燥，可以是丙酮、乙醇有机溶剂沉淀溶液中的蛋白质，若是无水乙醇，终浓度为70～90％，以80％为优，收集沉淀后脱水、真空干燥，也可以直接冷冻干燥或用超滤等方法浓缩脱盐后冻干，干燥以冻干为优。经过以上步骤得到的绝经后尿促性腺素蛋白，尿促卵泡素生物效价大于每毫克4000国际单位，尿促卵泡素与人尿黄体生成素生物活性的比例根据需要，可以是1∶1、2∶1或3∶1，也可以是其他合适的比例，所获得的绝经后尿促性腺素蛋白质，可以按照已知的方法指标成冻干制剂，制剂含有适当的赋形剂，可以是甘露醇、乳糖、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖或它们的混合物，也可含有适当的保护剂，如人血白蛋白。
由于本发明选用了从绝经后妇女尿液中提取得到的高纯度尿
促卵泡素蛋白和高纯度人尿黄体生成素蛋白为原料，生产出绝经后尿促性腺素，从而确保了绝经后尿促性腺素质量的高纯度。 具体实施方式：
下面对本发明的生产高纯度的绝经后尿促性腺素的方法的实施例作进一步详细描述。
本实施例中所用的高纯度尿促卵泡素和人尿黄体生成素原料，来自上海天伟生物制药有限公司，其中尿促卵泡素效价9250IU/m，尿促卵泡素与人尿黄体生成素之比大于100∶1，人尿黄体生成素效价8100IU/mg，人尿黄体生成素与尿促卵泡素之比大于100∶1。
实施例1：
尿促卵泡素与人尿黄体生成素之比为1∶1的高纯度绝经后尿促性腺素生产，称取100毫克高纯度尿促卵泡素，114毫克高纯度人尿黄体生成素，溶解于50毫升0.01M NH4AC，pH7.0无热原缓冲液，于12℃下磁力搅拌30分钟，成澄清、透明溶液，分装于无热原不锈钢盘中，液面高1厘米，-40℃速冻。溶液冻结后冷冻干燥。24小时后出箱，得干粉208毫克。尿促卵泡素生物效价为4320IU/mg，人尿黄体生成素生物效价为4450 IU/mg。尿促卵泡素与人尿黄体生成素之比等于0.97∶1。 实施例2：
尿促卵泡素与人尿黄体生成素之比为2∶1的高纯度绝经后尿促性腺素生产，称取100毫克高纯度尿促卵泡素，57毫克高纯度人尿黄体生成素，溶解于50毫升0.01M NH4AC，pH7.0无热原缓冲液，于12℃下磁力搅拌30分钟，成澄清、透明溶液，分装于无热原不锈钢盘中，液面高1厘米，-40℃速冻。溶液冻结后冷冻干燥。24小时后出箱，得干粉150毫克。尿促卵泡素生物效价为5920IU/mg，人尿黄体生成素生物效价为2918IU/ m g。尿促卵泡素与人尿黄体生成素之比等于2.02∶1。 实施例3：
尿促卵泡素与人尿黄体生成素之比为3∶1的高纯度绝经后尿促性腺素生产，称取100毫克高纯度尿促卵泡素，38毫克高纯
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