(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810678248.1
(22)申请日 2018.06.27
(83)生物保藏信息
CCTCC NO:M2017802 2017.12.18
(71)申请人 中国热带农业科学院海口实验站
地址 570102 海南省海口市龙华区义龙西
路2号
(72)发明人 谭琳 谭凯 伊莎贝尔 范梦凯
孙香荣
(74)专利代理机构 北京汇思诚业知识产权代理
有限公司 11444
代理人 王刚 龚敏
(51)Int.Cl.
C12P 17/10(2006.01)
C07D 209/12(2006.01)
A61P 19/06(2006.01)C12R 1/63(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明提供一种制备吲哚-3-甲醛的方法，
包括以下步骤：(1)将新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2
心去掉菌体，收获发酵上清液；(2)用有机溶剂萃
取发酵上清液，将有机相减压浓缩，获得粗提物；
(3)从得到的粗提物中分离出吲哚-3-甲醛。本发
明通过微生物发酵法生产吲哚-3-甲醛，只需采
用简单的培养基对微生物进行培养就可以获得
大量的吲哚-3-甲醛。本发明的方法不仅成本低
廉，而且比化学合成的方式环保。吲哚-3-甲醛的
体外酶活性实验显示其具有强黄嘌呤氧化酶抑
制活性，在高尿酸血症和痛风症方面具有巨
大的开发潜力和应用前景。权利要求书1页 说明书5页 附图5页CN 108624633 A 2018.10.09
C N 108624633
A
1.一种制备吲哚-3-甲醛的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2接种到LB液体培养基中进行培养，培养结束后离心去掉菌体，收获发酵上清液；
(2)用有机溶剂萃取发酵上清液，将有机相减压浓缩，获得粗提物；
(3)从得到的粗提物中分离出吲哚-3-甲醛。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl的浓度为2％(g/ml)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2在25～32℃的温度下培养7～15天。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，乙酸乙酯与发酵液的体积比为3～1：1，萃取进行3次，每次萃取12～36小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，减压浓缩在40℃～45℃的温度下进行。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述分离为：采用硅胶柱进行层析，收集目标洗脱液，浓缩除去有机溶剂，得到吲哚-3-甲醛。 8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述层析的操作如下：
(A)将乙酸乙酯粗提物用硅胶柱进行层析，以100％的正己烷，体积比为8.5～9∶1～1.5的正己烷-乙酸乙酯、体积比为7.5～8∶2～2.5的正己烷-乙酸乙酯、体积比为6.5～7∶3～
3.5的正己烷-乙酸乙酯、体积比为5.5～6∶4～
4.5的正己烷-乙酸乙酯、体积比为4.5～5∶
4.5～5的正己烷-乙酸乙酯，体积比为100％的乙酸乙酯、体积比为8.5～9∶1～1.5的乙酸乙酯-甲醇、体积
比为6.5～7∶3～3.5的乙酸乙酯-甲醇、体积比为4.5～5∶4.5～5的乙酸乙酯-甲醇、100％的甲醇进行洗脱，根据洗脱液流出顺序和薄层层析谱的检测结果，将组分合并成7个亚组分F1～F7；
(B)对步骤(A)得到的亚组分F6继续用硅胶柱进行层析，依次用体积比为6～8∶2～4的正己烷-丙酮、体积比为5～7∶3～5的正己烷-丙酮，体积比为1～2∶1～2的正己烷-丙酮、体积比为100％丙酮、100％甲醇进行洗脱，根据洗脱液流出顺序和薄层层析谱的检测结果，将洗脱液分成3个亚组分F6.1、F6.2和F6.3；
(C)对(B)步骤得到的亚组分F6.2用硅胶柱进行层析，依次用体积比为6～8∶2～4的正己烷-丙酮、体积比为1～2∶1～2的正己烷-丙酮、体积比为100％甲醇依次进行梯度洗脱，根据洗脱液流出顺序和薄层层析谱的检测结果，将洗脱液分成两个亚组分F6.2.1和F6.2.2；
(D)对步骤(C)得到的F6.2.1用制备型薄层层析板分离，流动相为体积比为5～7∶3～5的正己烷-丙酮，获得三个亚组分为F6.2.1.1、F6.2.1.2和F6.2.1.3，其中F6.2.1.1为吲哚-3-甲醛。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(A)、(B)和(C)中，硅胶柱所用的填料为60-100目的硅胶。
10.吲哚-3-甲醛在制备用于高尿酸血症和/或痛风症的药物中的用途。
权 利 要 求 书1/1页CN 108624633 A
一种吲哚-3-甲醛的制备方法及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及医药技术领域，具体地涉及一种采用微生物发酵法制备吲哚-3-甲醛的方法及其吲哚-3-甲醛在制备用于高尿酸血症和痛风症的药物中的应用。
背景技术
[0002]尿酸是人体嘌呤代谢的产物，由于尿酸在体液中溶解度有限，当体内嘌呤代谢紊乱或摄入嘌呤过多导致体内嘌呤含量过高，产生尿酸过多/或者尿酸排泄减少，体液中蓄积的尿酸浓度超过其饱和浓度时，易在组织中析出结晶，引发高尿酸血症(hyperuricemia)，约有5％～12％的高尿酸血症患者最终发展为痛风(gout)。痛风已成为继糖尿病之后的第二大代谢性疾病。因此，加强对高尿酸血症、痛风的预防和具有重要的现实意义。[0003]黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)是高尿酸血症或痛风发生与发展的关键酶，黄嘌呤氧化酶抑制剂由于具有作用机制明确、疗效显著等优点，倍受关注。自20世纪60年代以来，临床上最常使用的XO抑制剂是别嘌呤醇。最近，另一个XO抑制剂非布索坦也已经上市，并显示出良好的效果。然而，无论是别嘌呤醇还是非布索坦，在临床上都表现出一些明显的不良反应，
如过敏、肝功能异常、腹泻、头痛、皮疹、恶心等，而新药非布索坦的价格十分昂贵，也给人们带来了一定的经济负担。因此，高效低毒的XO抑制活性化合物，是药学领域研究的热点。
[0004]吲哚-3-甲醛是合成很多具有生理活性和药理活性化合物的原料，也是有机合成中一类重要的中间体，用途非常广泛。刘仲齐等用吲哚-3-甲醛合成的吲哚甲酸，作为植物生长剂调节小麦等作物的生长；徐美华等研究了以吲哚-3-甲醛合成的药物吲哚美辛抗肿瘤的作用机理。陈祥等采用KMnO4氧化吲哚-3-甲醛制得吲哚-3-甲酸。陈桃红等以吲哚-3-甲醛为原料合成了4个新的甲氧羰基吲哚-3-甲醛苯醇化合物，可用于合成医药和农药。[0005]在自然界中，目前发现菜豆的黄化苗、西红柿幼苗、大麦等植物含有微量的吲哚-3-甲醛。因此，一直以来，人们主要通过化学合成的方式来获得吲哚-3-甲醛。1945年，Blume 小组通过Reimer-Tiemann反应制得吲哚-3甲醛，得到52％的收率，但反应选择性差，产物不唯一(Blume R C,Lindwall H G.J.Org.Chem.,1945,10:255)。1994年，Macor等使用酰氯和格氏试剂合成3-甲酰吲哚，但格氏试剂是很强的亲核试剂，很容易与酰氯发生亲核反应，这也是造成此反应方法产率低(45％)的原因之一(Macor J E,Blank D H,Fox C B,et al.J.Med.Chem.,1994,37:2509)。2010年，Taylor等对合成3-酰基吲哚的傅-克酰基化方法进行了改进，不同于传统的傅-克酰基化反应，改进后的反应中采用的催化剂是DBN，使得产率可达到57％-100％，解决了传统工艺中需要严格无水的苛刻条件，但是催化剂价格昂贵、反应物与产物难以分离、实验条件苛刻以及产率较低等缘故限制了其工业应用(Taylor J E,Matthew D J,Jonathan M.J.Org.Lett.,2010,12:5740201)。
发明内容
[0006]本发明中所使用的新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2于2017年12月18日保藏于中国典型
培养物保藏中心(CCTCC)，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2017802。
[0007]本发明提供了一种采用微生物发酵法制备吲哚-3-甲醛的方法，该方法包括以下步骤：
[0008](1)将新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2接种到LB液体培养基中进行培养，培养结束后离心去掉菌体，收获发酵上清液；
[0009](2)用有机溶剂萃取发酵上清液，将有机相减压浓缩，获得粗提物；
[0010](3)从得到的粗提物中分离出吲哚-3-甲醛。
[0011]优选地，在本发明方法的步骤(1)中，LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl浓度为2％(g/ml)。培养基的种类对发酵得到的产物也会产生影响，经后续的表征数据可知，本发明的发酵法得到的产物为吲哚-3-甲醛。此外，发明人发现，高盐浓度对菌种的发酵和吲哚-3-甲醛的生成更加有利。
[0012]新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2接种到LB液体培养基后，较佳的培养温度为25～32℃培养，培养时间视具体情况而定，一般7～15天均可生成预期产量的吲哚-3-甲醛。[0013]优选地，在本发明方法的步骤(2)中，所述有机溶剂为乙酸乙酯；更优选地，乙酸乙酯与发酵液的体积比为3～1∶1，萃取进行3次，每次萃取12～36小时，优选24小时。[0014]优选地，在本发明方法的步骤(2)中，减压浓缩在40℃～45℃的温度下进行。经实验发现，温度过高会影响粗提物中化合物的活性。
[0015]本领域技术人员可以采用常见的层析柱和适合的洗脱剂对粗提物进行层析，从而得到目标产物吲哚-3-甲醛。在此，本发明提供了一种较优的层析操作。
[0016]在本发明方法的步骤(3)中，可以采用本领域熟知的多种方法对粗提物中的吲哚-3-甲醛进行分离。本发明提供的一种方法是采用硅胶柱将粗提物进行层析，收集目标洗脱液，浓缩除去有机溶剂，得到吲哚-3-甲醛。
[0017]优选地，在本发明方法的步骤(3)中，所述层析的操作如下：
[0018](A)将乙酸乙酯粗提物用硅胶柱进行层析，以正己烷(100％)，体积比为(8.5～9∶1～1.5)的正己烷-乙酸乙酯、体积比为(7.5～8∶2～2.5)的正己烷-乙酸乙酯、体积比为(6.5～7∶3～3.5)的正己烷-乙酸乙酯、体积比为(5.5～6∶4～4.5)的正己烷-乙酸乙酯、体积比为(4.5～5∶4.5～5)的正己烷-乙酸乙酯，体积比为(100％)的乙酸乙酯、体积比为(8.5～9∶1～1.5)的乙酸乙酯-甲醇、体积比为(6.5～7∶3～3.5)的乙酸乙酯-
甲醇、体积比为(4.5～5∶4.5～5)的乙酸乙酯-甲醇、甲醇(100％)的进行洗脱，根据洗脱液流出顺序和薄层层析谱(TLC)的检测结果，将组分合并成7个亚组分F1～F7；
[0019](B)对步骤(A)得到的亚组分F6继续用硅胶柱进行层析，依次用体积比为(6～8∶2～4)的正己烷-丙酮、体积比为(5～7∶3～5)的正己烷-丙酮，体积比为(1～2∶1～2)的正己烷-丙酮、体积比为100％的丙酮、100％甲醇进行洗脱，根据洗脱液流出顺序和薄层层析谱的检测结果，将洗脱液分成3个亚组分F6.1、F6.2和F6.3；
[0020](C)对(B)步骤得到的亚组分F6.2用硅胶柱进行层析，依次用体积比为(6～8∶2～4)的正己烷-丙酮、体积比为(1～2∶1～2)的正己烷-丙酮、体积比为100％甲醇一次进行梯度洗脱，根据洗脱液流出顺序和薄层层析谱的检测结果，将洗脱液分成两个亚组分F6.2.1和F6.2.2；
[0021](D)对步骤(C)得到的F6.2.1用制备型薄层层析板分离，流动相为体积比为(5～7∶
3～5)的正己烷-丙酮，获得三个亚组分为F6.2.1.1、F6.2.1.2和F6.2.1.3，其中F6.2.1.1为吲哚-3-甲醛。
[0022]在本发明方法的步骤(3)中，所述层析操作进行3次，前一次层析收集的目标洗脱液用作后一次层析操作的原料。
[0023]根据本发明方法的一种实施方案，在步骤(A)、(B)和(C)中，硅胶柱所用的填料为60～100目的硅
胶。
[0024]本发明还提供吲哚-3-甲醛在制备用于高尿酸血症和/或痛风症的药物中的用途。
[0025]有益效果
[0026]本发明通过微生物发酵法生产吲哚-3-甲醛，不需要使用昂贵的催化剂和复杂的工艺，只需采用简单的培养基对微生物进行培养就可以获得大量的目标化合物。本发明提供的吲哚-3-甲醛的制备方法不仅成本低廉，而且比化学合成的方式环保。本发明正是通过对新喀里多尼亚弧菌CGJO2-2的大量发酵，然后通过硅胶柱和薄层层析谱分离而获得高纯度的吲哚-3-甲醛，步骤简单，得率高(以粗提物为基准，得率可达0.28％以上)。获得的吲哚-3-甲醛可以用作许多活性物质的合成原料，并且其体外酶活性实验显示其具有很强的黄嘌呤氧化酶抑制活性，其IC50值为4.17μg/mL，在高尿酸血症和痛风症方面具有巨大的开发潜力和应用前景。
附图说明
[0027]图1是根据本发明的方法制备得到的目标产物的1H-NMR图谱；
[0028]图2是根据本发明的方法制备得到的目标产物的13C-NMR图谱；
[0029]图3是根据本发明的方法制备得到的目标产物的COSY图谱；
[0030]图4是根据本发明的方法制备得到的目标产物的HMBC图谱；
[0031]图5是根据本发明的方法制备得到的目标产物的HSQC图谱。
具体实施方式
[0032]实施例1
[0033]吲哚-3-甲醛的制备
[0034]1、新喀里多尼亚弧菌的培养和发酵
[0035]从2216E固体平板上用接种环接种新喀里多尼亚弧菌单菌落CGJ02-2(2017年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC M 2017802)至6个各含有100ml含NaCl为2％(g/ml)LB液体培养基的250ml三角瓶中，28℃～30℃，160rpm，过夜培养。将活化的菌液，按照1：50的比例用含有NaCl为2％的LB培养基进行扩大培养，总体积为16L，28℃～30℃，120rpm培养10～12天。将发酵液用高速离心机，离心8000rpm离心10分钟，去掉菌体，收获上清液。
[0036]2、发酵液的浸提
[0037]将培养液上清浸渍于等体积乙酸乙酯中24小时，期间不断摇动。然后，用分液漏斗将有机相和水相分开。水相再加入等量的乙酸乙酯重新浸渍24小时(每升培养液上清浸渍三次)，用分液漏斗将有机相和水相分开。收集三次萃取获得的有机相，用旋转蒸发仪蒸干。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议