(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810666307.3
(22)申请日 2018.06.26
(71)申请人 辽宁禾丰牧业股份有限公司
地址 110164 辽宁省沈阳市沈北新区辉山
大街169号
(72)发明人 韩金
(74)专利代理机构 北京轻创知识产权代理有限
公司 11212
代理人 谈杰
(51)Int.Cl.
G01N 30/06(2006.01)
G01N 30/02(2006.01)
(54)发明名称一种饲料中抗生素类药物的检测方法(57)摘要本发明属于饲料领域，公开了一种饲料中抗生素类药物的检测方法。该方法包括样品处理过程，(1)向待检测饲料样品中加入提取液，涡旋振荡、超声提取后，离心，将上清液用氮气吹干得残渣，向残渣中加入磷酸盐缓冲溶液溶解残渣，得到复溶液；(2)取固相萃取柱进行活化，将所得的复溶液过柱，依次用水、淋洗液进行淋洗，洗脱液进行洗脱，收集洗脱后的溶液，氮气吹干，然后用溶解液溶解，过滤，得到待检测的净化液。本发明的方法能够有效减少其他结构相似同类药物的干扰，使用合理的定量方法实现准确定量，建立一种操作简单快速、灵敏度高、准确可靠、选择性强的交沙霉素的检测方法，可准确检测出饲料中 交沙霉素的含量。权利要求书2页 说明书18页 附图4页CN 108982715 A 2018.12.11
C N 108982715
A
1.一种饲料中抗生素类药物的检测方法，其特征在于，包括样品处理过程，具体如下：
(1)向待检测饲料样品中加入提取液，涡旋振荡、超声提取后，离心，将上清液用氮气吹干得残渣，向残渣中加入磷酸盐缓冲溶液溶解残渣，得到复溶液；
(2)取固相萃取柱进行活化，将所得的复溶液过柱，依次用水、淋洗液进行淋洗，洗脱液进行洗脱，收集洗脱后的溶液，氮气吹干，然后用溶解液溶解，过滤，得到待检测的净化液。
2.根据权利要求1所述的一种饲料中抗生素类药物的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05-0.2mol/L，pH为7.5-8.5；
优选的，磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1mol/L，pH为8.0。
3.根据权利要求1或2所述的一种饲料中抗生素类药物的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的提取液为甲醇和乙腈的混合溶液，所述的甲醇和乙腈的体积比为1:0.25-4；
优选的，所述的甲醇和乙腈的体积比为1:1。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种饲料中抗生素类药物的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的提取液与待检测饲料样品的提取比为2.5ml/g-200ml/g；
优选的，所述的提取液与待检测饲料样品的提取比为5ml/g-50ml/g；
更优选的，提取比为10ml/g-20ml/g。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种饲料中抗生素类药物的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的淋洗液为体积分数为5％的甲醇水溶液，洗脱液为甲醇，溶解液为体积分数为40％的甲醇水溶液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种饲料中抗生素类药物的检测方法，其特征在于，饲料为配合饲料，处理过程包括：
(1)取配合饲料样品加入提取液，提取液与配合饲料样品的提取比为2.5ml/g-20ml/g，涡旋振荡混合15～25min，超声提取15～20min，离心，取上清液于浓缩管中，氮气吹干后，加入磷酸盐缓冲溶液溶解残渣，为复溶液；
(2)取HLB固相萃取柱进行活化，将所得的复溶液过柱，依次用水、淋洗液进行淋洗，洗脱液进行洗脱，收集洗脱后的溶液，氮气吹干，然后用40％的甲醇水溶液溶解，过滤，得到待检测的净化液。
7.根据权利要求1-5任一项所述的一种饲料中抗生素类药物的检测方法，其特征在于，饲料为浓缩饲料，处理过程包括：
(1)取浓缩饲料样品加入提取液，提取液与浓缩饲料样品的提取比为5ml/g-30ml/g，涡旋振荡混合15～30min，超声提取15～30min，离心，取上清液于浓缩管中，氮气吹干后，加入磷酸盐缓冲溶液溶解残渣，为复溶液；
(2)取HLB固相萃取柱进行活化，将所得的复溶液过柱，依次用水、淋洗液进行淋洗，洗脱液进行洗脱，收集洗脱后的溶液，氮气吹干，然后用40％的甲醇水溶液溶解，过滤，得到待检测的净化液。
8.根据权利要求1-5任一项所述的一种饲料中抗生素类药物的检测方法，其特征在于，饲料为预混合饲料，处理过程包括：
(1)取预混合饲料样品加入提取液，提取液与预混合饲料样品的提取比为5ml/g-200ml/g，涡旋振荡混合20～40min，超声提取20～30min，离心，取上清液于浓缩管中，氮气吹干后，加入磷酸盐缓冲溶液溶解残渣，为复溶液；
(2)取HLB固相萃取柱进行活化，将所得的复溶液过柱，依次用水、淋洗液进行淋洗，洗脱液进行洗脱，收集洗脱后的溶液，氮气吹干，然后用40％的甲醇水溶液溶解，过滤，得到待检测的净化液。
9.一种饲料中抗生素类药物的检测方法，其特征在于，包括样品检测过程，样品检测过程为将待测饲料样品的净化液采用液相谱-质谱法进行检测和定量；液相谱的流动相包括A：乙腈，B：体积分数为0.1％的甲酸水溶液，并采用梯度洗脱程序洗脱；
优选的，净化液为权利要求1-8任一项所述的净化液；
优选的，定量采用相同基质提取前添加适量标准物质的方式。
10.根据权利要求9所述的一种饲料中抗生素类药物的检测方法，其特征在于，所述的梯度洗脱程序为：0～1.0min，A的比例为10％；1.0～11min，A的比例由10％匀速提高到62％；11～12min，A的比例由62％匀速提高到90％；12～13min，A的比例由90％匀速降低到10％；13～14min，A的比例10％。
一种饲料中抗生素类药物的检测方法
技术领域
[0001]本发明属于饲料领域，尤其涉及一种饲料中抗生素类药物的检测方法。
背景技术
[0002]近些年来，养殖业使用抗生素类药物防治疾病或将抗生素类药物加入饲料中以促进动物生长已经是很普遍的现象。动物在使用药物后，药物的原形或其代谢产物可能蓄积、储存在动物的细胞、组织或器官中，形成“药物残留”。抗生素通过食物链进入人体后，将对人类健康构成严重的危害。长期过量或不当使用抗生素还会引起细菌耐药性问题。[0003]近些年来，抗生素滥用的问题越来越严重，“超级细菌”的出现更是引起了人们的极大关注。大环内酯类抗生素广泛用于畜禽的呼吸道疾病和肠道细菌感染，也被加入饲料中，用于促进畜禽生长，提高饲料转化率。以交沙霉素和吉他霉素为代表的大环内酯类抗生素是临床细菌性和支原体感染的常用抗菌素。吉他霉素不仅可以促进畜禽生长，并可大大提高饲料转化率，被作为饲料添加剂广泛使用。交沙霉素是由链霉菌产生的十六元环结构的内酯类抗生素，是典型的大环内酯类抗生素，对革兰氏阳性菌及支原体的抑制活性较高，常用于葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌和杆菌的感染。交沙霉素作为人用药物，主要用于呼吸道疾病，如肺炎支原体所致的肺炎和链球菌引起的咽炎及扁桃体炎。交沙霉素(吉他霉素A3)的化学结构式如式I所示。
[0004]
[0005]随着大环内酯类抗生素在养殖业中的大量使用，交沙霉素的滥用和残留问题引起的食品安全问题也随之而来；饲料中含有交沙霉素并饲喂于动物，进而导致食品中交沙霉素的残留，不仅会引起过敏，还会导致携带耐药基因的扩散，人类抗药性发生变化，使人类面对动物源性疾病时无能为力。我国《兽药管理条例》第四十一条第三款明确规定，禁止将人用药品用于动物。因此需要建立一种高效、准确的检测方法测定饲料中交沙霉素的含量，从源头有效地保障畜禽产品质量安全。
[0006]交沙霉素的检测方法包括微生物效价法、薄层谱法、免疫分析法、高效液相谱法、气质联用法等。微生物效价法选择性低，特异性不高；薄层谱法虽然有设备简单和操作简便快速的优点，但分离能力较差，检测灵敏度较低；免疫分析法是近年发展起来的新型分析方法，具有良好的特异性和灵敏度，但影响因素多且难以控制，重现性差；高效液相谱法通常使用紫外检测器，检测交沙霉素时容易出现灵敏度低，干扰大的现象；交沙霉素结构中带有多个极性基团，不能直接采用气质联用法检测，必须衍生后才可以检测，由于衍生
过程繁琐，样品前处理过程较复杂，限制了该方法的应用。目前现行的国家标准方法和地方标准方法没有关于饲料中交沙霉素的测试方法，只有针对动物源性食品(SN/T 1777.2-2007)和某些鱼(GB/T 22964-2008)中交沙霉素的检测方法，这两个标准方法针对性强，不适用于饲料中交沙霉素的检测。而国内外现有的文献，也鲜有关于饲料中交沙霉素的检测方法。
[0007]通过将药物加入到饲料中饲喂动物是目前动物疾病的常见方法，为了保障畜禽养殖业健康有序发展，从源头保障农牧产品的安全，控制和限制抗生素在养殖业中的不合理使用，亟需开发一种高效而准确的动物饲料中交沙霉素的检测方法。
[0008]有鉴于此特提出本发明。
发明内容
[0009]本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种饲料中抗生素类药物的检测方法，能够有效减少其他结构相似同类药物的干扰，使用合理的定量方法实现准确定量，建立一种操作简单快速、灵敏度高、准确可靠、选择性强的交沙霉素的检测方法，可准确检测出饲料中交沙霉素的含量。
[0010]为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
[0011]本发明的第一目的是提供一种饲料中抗生素类药物的检测方法，包括样品处理过程，具体如下：
[0012](1)向待检测饲料样品中加入提取液，涡旋振荡、超声提取后，离心，将上清液用氮气吹干得残渣，向残渣中加入磷酸盐缓冲溶液溶解残渣，得到复溶液；
[0013](2)取固相萃取柱进行活化，将所得的复溶液过柱，依次用水、淋洗液进行淋洗，洗脱液进行洗脱，收集洗脱后的溶液，氮气吹干，然后用溶解液溶解，过滤，得到待检测的净化液。
[0014]本发明的检测方法中向残渣中加入磷酸盐缓冲溶液，溶解残渣，同时磷酸盐缓冲溶液作为固相萃取柱的上样液，配合固相萃取。本发明所使用的是非极性填料的固相萃取柱，目标物为碱性。考虑到这种萃取柱的萃取原理和填料中硅醇键呈现的离子状态，本发明选用的过柱液体是磷酸盐缓冲溶液，这种弱碱性的液体会增加目标物的保留，这样在淋洗的时候，干扰物会被淋洗掉，而目标物则能够更好地保留。
[0015]另外，本申请中采用涡旋振荡配合超声的提取方式，提取更加充分。使用氮气吹干的方式进行浓缩，可减少浓缩过程中样品发生损失的问题。
[0016]进一步的方案，步骤(1)中，所述的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05-0.2mol/L，pH为7.5-8.5；
[0017]优选的，磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1mol/L，pH为8.0。
[0018]进一步的方案，步骤(1)中，所述的提取液为甲醇和乙腈的混合溶液，所述的甲醇和乙腈的体积比为1:0.25-4；
[0019]优选的，所述的甲醇和乙腈的体积比为1:1。
[0020]进一步的方案，步骤(1)中，提取液与待检测饲料样品的提取比为2.5ml/g-200ml/ g。
[0021]需要说明的是，本发明中所述的提取比指的是单位质量的待测饲料样品所需的提
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