(10)申请公布号 (43)申请公布日 2015.01.28
C N 104313132
A
(21)申请号 201410502171.4(22)申请日 2014.09.28
C12Q 1/68(2006.01)C12Q 1/48(2006.01)
(71)申请人南京诺唯赞生物科技有限公司
地址210014 江苏省南京市玄武区孝陵卫双
拜巷78号D 座(72)发明人徐晓昱 刘来花 王静
(74)专利代理机构南京正联知识产权代理有限
公司 32243
代理人
王素琴(54)发明名称
本发明公开了一种T4 DNA 聚合酶活性测定方法，所述方法包括：在无dNTP 存在的情况下，在以双链线性DNA 模板为底物的反应体系中加入T4 DNA 聚合酶，反应完成后检测双链DNA 的相对量，由此测出T4 DNA 聚合酶的外切酶活性，并使T4 DNA 聚合酶的外切酶活性与聚合酶活性相关，得到T4 DNA 聚合酶的聚合酶活性程度。本发明通过便利地测量外切酶活性，利用T4 DNA 聚合酶的外切酶活性与聚合酶 活性的相关性测量聚合酶活性。与现有技术的方法相比，无放射性污染，操作简单快速，并且克服了外切酶活性对聚合酶活性测定的干扰，得到的结果因此更准确。(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书5页 附图3页
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书5页 附图3页(10)申请公布号CN 104313132 A
1. 一种T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：在无dNTP 存在的情况下，在以双链线性DNA模板为底物的反应体系中加入T4 DNA聚合酶，反应完成后检测双链DNA的相对量，由此测出T4 DNA聚合酶的外切酶活性，并使T4 DNA聚合酶的外切酶活性与聚合酶活性相关，得到T4 DNA聚合酶的聚合酶活性程度。
2. 如权利要求1所述的T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，双链DNA的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA的相对量是以荧光强度表示的。 3. 如权利要求2所述的T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。
4. 如权利要求3所述的T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所采用的染料是picogreen染料。
5. 如权利要求1所述的T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所采用的双链线性DNA模板是以λDNA为底物，在正向和反向引物的存在下通过PCR扩增获得的线性双链DNA。
6. 如权利要求5所述的T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所用正向引物为5’-aataacgtcggcaactttgg-3’，反向引物为5’-gttacgccaccagtcatcct-3’。
一种T4 DNA聚合酶活性测定方法
技术领域
[0001] 本发明属于生化技术领域，具体来说涉及一种T4 DNA聚合酶活性测定方法。
背景技术
[0002] T4 DNA聚合酶由T4噬菌体聚合酶I基因编码，具有5’-3’聚合酶活性以及3’-5’外切酶活性。T4 DNA聚合酶是基因工程技术中一种重要的工具酶，可用于双链DNA末端的平滑化。在高通量测序（next generation sequencing）文库构建的过程中，片段化的DNA 末端首先需要用T4 DNA聚合酶平滑化，再经过T4多聚核苷酸激酶加磷酸后，才能与双链DNA接头进行连接。
[0003] 标准的T4 DNA聚合酶测活方法采用放射性同位素法。T4 DNA聚合酶可以催化将32P标记的dNTP掺入到小牛胸腺DNA中。经过TCA沉淀、whatman滤纸过滤，通过测定酸不溶性物质中放射性的含量，计算聚合酶活性。这种方法易产生放射性污染，且步骤多、周期长，难以实现高通量、自动化。
[0004] Seville等（Biotechniques. 1996 Oct；21(4):664）建立了一种基于荧光的DNA 聚合酶活性测定方法，其原理如图1所示。
[0005] DNA聚合酶可以M13单链环状DNA为模板催化聚合反应，生成M13双链环状DNA。双链环状DNA产物可以被双链DNA特异性的picogreen染料结合，产生荧光，从而测定DNA 聚合酶活性。
[0006] 但是本发明人发现，这种方式不适用于T4 DNA聚合酶的活性测定。因为T4 DNA 聚合酶具有很强的3’-5’外切酶活性，在该测活体系中，3’-5’外切酶活性会在很大程度上抵消聚合酶活性，造成聚合酶活性难以测定。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于建立一种非放射性、简便、快速的外切酶活性测定方法，其原理如图2所示。
[0008] 具体来说，本发明采用的是以下技术方案：
一种T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：在无dNTP存在的情况下，在以双链线性DNA模板为底物的反应体系中加入T4 DNA聚合酶，反应完成后检测双链DNA的相对量，由此测出T4 DNA聚合酶的外切酶活性，并使T4 DNA聚合酶的外切酶活性与聚合酶活性相关，得到T4 DNA聚合酶的聚合酶活性程度。
[0009] 优选地，双链DNA的相对量是利用荧光染料，例如仅与双链DNA或仅与单链DNA结合的荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA的相对量是以荧光强度表示的。[0010] 更优选，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料，更优选为市售的成熟商用荧光染料，例如picogreen染料。
[0011] 在一个实施方案中，本发明方法中所采用的双链线性DNA模板是以λDNA为底物，在正向和反向引物的存在下通过PCR扩增获得的线性双链DNA，以便建立一种标准的测量
方法。
[0012] 在一个进一步的实施方案中，所用正向引物为5’-aataacgtcggcaactttgg-3’，反向引物为5’-gttacgccaccagtcatcct-3’。
[0013] 本发明的优点：
1. 无放射性污染；
2. 操作步骤简单快速，无需TCA沉淀、洗涤、干燥、洗脱步骤；可实现高通量、自动化的活性测定。
[0014] 3. 建立了T4 DNA聚合酶的外切酶活性和聚合酶活性的定量关系，通过方便的测定外切酶活性，克服了外切酶活性对聚合酶活性测定的干扰，测量结果更准确。
附图说明
[0015] 图1是现有技术中测定DNA聚合酶活性的技术原理图。
[0016] 图2是本发明的测定T4 DNA聚合酶活性的技术原理图。
[0017] 图3是现有技术的荧光法测定大肠杆菌pol I和T4 DNA聚合酶获得的荧光酶活曲线图。
[0018] 图4是利用本发明的方法测定T4 DNA聚合酶获得的荧光酶活曲线图。
[0019] 图5是不同来源的T4 DNA聚合酶的荧光酶活曲线图。
具体实施方式
[0020] 在dNTP缺失的情况下，T4 DNA聚合酶失去聚合活性，但保留强的3’-5’外切酶活性，可从双链DNA的两个3’末端向内进行降解，表现出单纯的核酸外切酶的活性。因为T4 DNA聚合酶的聚合酶活性和外切酶活性分属不同结构域，
（MICHELLE et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90, pp. 2579-2583, April 1993)，本发明人假设，其聚合酶活性和外切酶活性的比例是一个恒定的值，可以通过测定其外切酶活性来推算出其聚合酶活性。
本发明首先建立了一种非放射性、简便、快速的外切酶活性测定方法，其原理如图2所示。[0021] 如图所示，在无dNTP存在的情况下，T4 DNA聚合酶可以从双链DNA的3’端开始降解，从而降低双链DNA的量。通过双链特异性的picogreen染料就可以测定T4 DNA聚合酶的外切酶活性。
[0022] 本发明人进一步证明了上述假设，从而建立了非放射性、简便、快速的T4 DNA聚合酶测定方法。
[0023] 下面将结合具体实施例来具体说明本发明。
[0024] 实施例1. 荧光法测定T4 DNA聚合酶的聚合酶活性
M13模板/引物复合物的制备：
M13单链DNA：M13mp18单链DNA (NEB)；
引物：M13引物5’-aagccatccgcaaaaatgacctct-3’；
M13模板/引物复合物：将M13mp18单链DNA同M13引物按摩尔比1:1混合，在退火缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl）中，70℃加热5分钟后，缓慢降至室温，使模板引物退火。
[0025] 2. 聚合酶反应
3. picogreen荧光检测：
向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。检测结果如下表：
大肠杆菌DNA聚合酶I酶量(mU)荧光数值
800.002288.
400.002199.
200.002119.
100.001949.
50.001673.
25.001300.
12.50966.
6.25676.
3.13567.
1.5647
2.
0.78422.
0.39400.
0380
T4DNA聚合酶I酶量(mU)荧光数值
800.00512.
400.00475.
200.00485.
100.00431.
50.00376.
25.00321.
12.50347.
6.25376.
3.13328.
1.56379.
0.78356.
0.39366.
0380.
以聚合酶活性单位(mU)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。如图3所示。
[0026] 如图3所示，E.coli pol I的活性-荧光强度可以很好的拟合出一条S型曲线，且荧光最大值与最小值的比值大于6，显示了本实施例方法良好的信噪比(S/B, signal/ baseline)。而T4 DNA聚合酶由于3’-5’外切酶活性过强，因此在本方法中严重干扰了聚合酶活性的测定，表现为荧光值和信噪比都过低，曲线无法正常拟合(R2<0.99)。因此本实施例方法不适用于T4 DNA聚合酶的聚合酶活性测定。
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