(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011597646.4
(22)申请日 2020.12.29
(71)申请人 华中农业大学
地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山
街1号
(72)发明人 马朝芝 窦胜玮 张彤 戴成
李兵 梁晓梅
(74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001
代理人 黄瑞棠
(51)Int.Cl.
C12N 15/113(2010.01)
C12N 15/29(2006.01)
C12N 15/82(2006.01)
A01H 5/00(2018.01)
A01H 6/20(2018.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种新的自交不亲和油菜种
质的创制方法，涉及植物基因工程技术领域。本
方法主要是：①在隐性亲和系油菜基因组中鉴定
出2个SMI2的同源序列：分别命名为BnS6‑SMI2和
BnS7‑SMI2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ
ID NO.2所示；②根据BnS6‑SMI2基因的特异序列
设计基于CRISSPR/Cas9的三个sgRNA，sgRNA1、
sgRNA2、sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、
SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。本发明证明
BnS6‑SMI2调控自交不亲和性，并利用CRISPR/
Cas9创造了不同突变类型的株系，其自交亲和性
比受体材料326显著降低；其自交后代表现明显
的自交不亲和表型，表明这项技术能够快速获得
油菜自交不亲和杂交育种提供了新的种质资源，
同时在油菜分子设计育种中具有广阔的应用前
景。权利要求书1页 说明书8页序列表4页 附图2页CN 112522272 A 2021.03.19
C N 112522272
A
1.一种利用CRISPR/Cas9编辑BnS6‑SMI2创制自交不亲和油菜种质的方法，其特征在于包括下列步骤：
①在隐性亲和系油菜基因组中鉴定出2个SMI2的同源序列：分别命名为BnS6‑SMI2和BnS7‑SMI2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；
②根据BnS6‑SMI2基因的特异序列设计基于CRISSPR/Cas9的三个sgRNA，sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；针对三个sgRNA序列设计的引物BnS6‑SMI2‑sR1‑F、BnS6‑SMI2‑sR1‑R、BnS6‑SMI2‑sR2‑F、BnS6‑SMI2‑sR2‑R、BnS6‑SMI2‑sR3‑F、BnS6‑SMI2‑sR3‑R序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；
③构建三靶点基因编辑载体pRGEBn ‑BnS6‑SMI2，载体构建所需引物L5AD5‑F、L3AD5‑R、S5AD5‑F、S3AD5‑R序列如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示；
④采用农杆菌转化的方式将pRGEBn ‑BnS6‑SMI2载体转至受体材料‘326’中，获得转基因植株；
⑤在转基因后代中筛选阳性苗植株，利用特异引物进行扩增，并将PCR产物送天一辉远生物科技公司进行测序，将测序结果进行比对，确定编辑形式。
2.按权利要求1所述方法的应用，其特征在于：
通过CRISPR/Cas9编辑BnS6‑SMI2，获得BnS6‑Smi2编辑的突变体L3、L8和L19；进一步观测基因编辑BnS6‑SMI2突变体的自交不亲和性状表型，发现突变体材料与受体材料相比表现明显的自交不亲和表型；证明BnS6‑Smi2突变体可以控制甘蓝型油菜自交不亲和性；利用CRISPR/Cas9系统定向突变BnS6‑Smi2获得稳定遗传的甘蓝型油菜的方法为甘蓝型油菜自交不亲和选育提供了新的种质资源，在油菜分子设计育种中具有广阔的应用前景。
权 利 要 求 书1/1页CN 112522272 A
一种新的自交不亲和油菜种质的创制方法
技术领域
[0001]本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种新的自交不亲和油菜种质的创制方法，具体是利用CRISPR/Cas9系统对甘蓝型油菜BnS6‑SMI2基因进行编辑，进而获得自交不亲和的油菜种质资源。
背景技术
[0002]油菜(Brassica napus L.)属芸薹科芸薹属，是我国重要的油料作物之一。优势利用是提高甘蓝型油菜产量的重要途径。自交不亲和是油菜优势利用途径之一。与细胞质雄性不育和细胞核雄性不育相比，自交不亲和优势利用具有育种程序简单、杂交种选育周期短、优势强、亲本繁育程序简便、良种生产成本低等优势。[0003]近年来，研究人员在芸薹科自交不亲和调控机制方面取得许多重要研究进展。芸薹科自交不亲和性主要受S单倍型内两个特异性识别的关键基因控制：S位点受体激酶SRK (S‑locus receptor kinase)和花药外被蛋白SCR/SP11(S‑locus cysteine rich pro tein/S‑locus pro tein 11)。在杂合S单倍型白菜中，显性S单倍型产生SCR methylation inducer 2(Smi2)调控隐性SCR转录水平表达，调控其自交不亲和性。迄今为止，甘蓝型油菜BnSmi2对其自交不亲和性的调控尚未被研究和应用。
[0004]目前，甘蓝型油菜自交不亲和系的创建主要有两种方法：一，将甘蓝型油菜与自交不亲和的白菜或甘蓝杂交创建自交不亲和甘蓝型油菜；二，利用转基因的方式，使调控甘蓝型油菜自交不亲和性的BnSCR1表达，创建自交不亲和甘蓝型油菜。这两种方法均存在着很大不足，前者需经过多代回交方可得到稳定遗传的自交不亲和油菜；后者自交不亲和性与转基因事件连锁，无法得到非转基因的自交不亲和油菜。
[0005]近年来，以CRISPR/Cas9(Clustered reg ula rly inters pa ced short palindromic repeats and CRISPR associated)技术为代表的基因组定点编辑技术成为植物育种技术的研究热点，同时也为油菜种质资源创新利用提供了安全、高效的新途径。[0006]利用CRISPR/Cas9技术定点编辑BnS6‑SMI2创制一种自交不亲和油菜新种质资源，为自交不亲和新品种的培育和基础研究奠定基础，具有重要的理论和实践价值。
发明内容
[0007]本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种新的自交不亲和油菜种质的创制方法；本发明的目的还在于BnS6‑Smi2编辑自交不亲和油菜在优势中的应用。
[0008]本发明的目的是这样实现的：
[0009]一、一种新的自交不亲和油菜种质的创制方法(简称方法)
[0010]具体地说，本方法包括下列步骤：
[0011]①在隐性亲和系油菜基因组中鉴定出2个SMI2的同源序列：分别命名为BnS6‑SMI2和BnS7‑SMI2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；
[0012]②根据BnS6‑SMI2基因的特异序列设计基于CRISSPR/Cas9的三个sgRNA，sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；针对三个sgRNA序列设计的引物BnS6‑SMI2‑sR1‑F、BnS6‑SMI2‑sR1‑R、BnS6‑SMI2‑sR2‑F、BnS6‑SMI2‑sR2‑R、BnS6‑SMI2‑sR3‑F、BnS6‑SMI2‑sR3‑R序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；
[0013]③构建三靶点基因编辑载体pRGEBn‑BnS6‑SMI2，载体构建所需引物L5AD5‑F、L3AD5‑R、S5AD5‑F、S3AD5‑R序列如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示；
[0014]④采用农杆菌转化的方式将pRGEBn‑BnS6‑SMI2载体转至受体材料‘326’中，获得转基因植株；
[0015]⑤在转基因后代中筛选阳性苗植株，利用特异引物进行扩增，并将PCR产物送天一辉远生物科技公司进行测序，将测序结果进行比对，确定编辑形式。
[0016]二、利用CRISPR/Cas9编辑BnS6‑SMI2创制自交不亲和油菜种质的应用
[0017]通过CRISPR/Cas9编辑BnS6‑SMI2，获得BnS6‑Smi2编辑的突变体L3、L8和L19；进一步观测基因编辑BnS6‑SMI2突变体的自交不亲和性状表型，发现突变体材料与受体材料相比表现明显的自交不亲和表型；证明BnS6‑Smi2突变体可以控制甘蓝型油菜自交不亲和性；利用CRISPR/Cas9系统定向突变B
nS6‑Smi2获得稳定遗传的甘蓝型油菜的方法为甘蓝型油菜自交不亲和选育提供了新的种质资源，在油菜分子设计育种中具有广阔的应用前景。
[0018]本发明具有下列优点和积极效果：
[0019]①采用本方法在甘蓝型油菜中特异性敲除BnS6‑SMI2基因，获得BnS6‑SMI2不同突变类型的单株，其自交亲和性相比受体材料326显著降低；
[0020]②利用CRISPR/Cas9系统定向突变BnS6‑SMI2获得自交不亲和且稳定遗传的甘蓝型油菜的方法为甘蓝型油菜自交不亲和选育提供了新的种质资源，同时极大提高育种效率，大大加快育种进程；
[0021]③为扩大油菜新杂交品种的培育和基础研究奠定基础，具有重要的理论和实践意义。
[0022]总之，本发明证明BnS6‑SMI2调控自交不亲和性，并利用CRISPR/Cas9创造了不同突变类型的株系，其自交亲和性比受体材料326显著降低；其自交后代表现明显的自交不亲和表型，表明这项技术能够快速获得自交不亲和且稳定遗传的甘蓝型油菜，为甘蓝型油菜自交不亲和杂交育种提供了新的种质资源，同时在油菜分子设计育种中具有广阔的应用前景。
附图说明
[0023]图1为pRGEBn‑BnS6‑SMI2载体示意图，其中：
[0024]包含一个由UBI启动子启动的Cas9、一个由35S启动子启动的HPTII(潮霉素抗性基因)、U3启动子启动tRNA‑sgRNA表达元件组和BsaI酶切位点。
[0025]图2为本发明获得的T
代部分转基因单株的编辑类型分析图。
[0026]图3为本发明获得的突变体材料T
代部分株系编辑类型和自交结籽考察，其中：
1
[0027]3a为BnS6‑SMI2基因模式图，深灰表示BnS6‑Smi2前体序列，浅灰表示BnS6‑Smi2，S1、S2和S3表示三个sgRNA；T
代L3、L8、L19株系BnS6‑Smi2编辑类型；
1
[0028]3b、3c为突变体自交结籽差异，L3‑3、L8‑2、L19‑1为不同突变类型株系；
代部分株系自交和正反交结籽考察，其中：[0029]图4为本发明获得的突变体T
2
[0030]4a为突变体自交和正反交结籽表型差异，L8‑2、L19‑1为不同突变株系；[0031]4b为突变体自交和正反交结籽表型统计差异，L8‑2、L19‑1为不同突变株系。
具体实施方式
[0032]下面结合附图和实施例详细说明：
[0033]下述试验方法如无特殊说明，均为本技术领域的常规方法和技术，所用试剂和耗材均可通过商业途径获取。
[0034]一、实施例
[0035]1、实施例1，基于CRISPR/Cas9系统定向突变甘蓝型油菜BnS6‑SMI2载体的构建：[0036]A、确定调控自交不亲和基因并确定基因编辑的sgRNA靶点序列
[0037]根据甘蓝型油菜参考基因组网站(cbi.hzau.edu/bnapus/index.php)中参考基因组ZS11的序
列信息，鉴定出2个SMI2的同源序列，分别命名为BnS6‑SMI2和BnS7‑SMI2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；
[0038]将BnS6‑SMI2基因序列提交CRISPR‑P(crispr.hzau.edu/CRISPR2/)网站，筛选确定脱靶率低的基因编辑靶点序列sgRNA1(核苷酸序列号如SEQ ID NO.3所示，TGG 为PAM序列)、sgRNA2(核苷酸序列号如SEQ ID NO.4所示，TGG为PAM序列)和sgRNA3(核苷酸序列号如SEQ ID NO.5所示，TGG为PAM序列)。
[0039]B、表达盒构建
[0040]以1ng的pGTR为模板进行PCR扩增；BnS6‑SMI2‑sR1‑F、BnS6‑SMI2‑sR1‑R、BnS6‑SMI2‑sR2‑F、BnS6‑SMI2‑sR2‑R、BnS6‑SMI2‑sR3‑F、BnS6‑SMI2‑sR3‑R、L5AD5‑F、L3AD5‑R的核苷酸序列号依次如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示；分别以L5AD5‑F和BnS6‑SMI2‑sR1‑R、BnS6‑SMI2‑sR1‑F和BnS6‑SMI2‑sR2‑R、BnS6‑SMI2‑sR2‑F和BnS6‑SMI2‑sR3‑R、BnS6‑SMI2‑sR3‑F和L3AD5‑R引物对，建立如下PCR体系，以如下PCR程序扩增DNA片段：
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