(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710854388.5
(22)申请日 2017.09.20
(71)申请人 广东容大生物股份有限公司
地址 511517 广东省清远市高新技术产业
开发区建设二路31号
(72)发明人 蒋顺进 方文棋 黄炜乾 郑雪媚
唐谢芳 张泳
(74)专利代理机构 广州胜沃园专利代理有限公
司 44416
代理人 徐翔
(51)Int.Cl.
C12N 1/14(2006.01)
A61K 36/068(2006.01)
A61P 27/02(2006.01)
A61P 27/10(2006.01)
C12R 1/645(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一
种地顶孢霉培养物及其应用。本发明地顶孢霉培
养物能够有效改善眼胀、眼痛、畏光、视物模糊、
眼睛干涩及视力下降等视疲劳症状；本发明地顶
孢霉培养物生产成本低、易于大规模获得，极为
有利于顶孢霉培养物在制备缓解视疲劳药物中
的应用。权利要求书1页 说明书5页CN 107475132 A 2017.12.15
C N 107475132
A
1.一种地顶孢霉培养物，其特征在于，所述地顶孢霉培养物的制备方法为：
S1.将地顶孢霉接种到斜面培养基中，于25-28℃培养4-5天，制得斜面试管菌种；
S2.将步骤S1制得的斜面试管菌种进行摇瓶培养，然后移至种子罐中进行种子培养，25-35℃，200-250rpm，培养20-50h，得种子培养液；
S3.将步骤S2制备得到的种子培养液按接种量20-25％接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中pH控制为5-7，培养温度控制在25-27℃，搅拌转速控制在110-130r/min，溶氧浓度控制在30％以上，发酵培养10h后向发酵罐中加入1.5g/L腺苷后，发酵20-30h； S4.将步骤S3得到的发酵液，进行超滤膜过滤、喷雾干燥即得。
2.根据权利要求1所述的地顶孢霉培养物，其特征在于，步骤S1中所用斜面培养基为马铃薯150-200g/L，葡萄糖15-25g/L，水1000mL，琼脂粉20g/L，pH6-7。
3.根据权利要求1所述的地顶孢霉培养物，其特征在于，步骤S2中所用种子培养基为：蔗糖30-50g/L，蛋白胨5-10g/L，酵母粉5-10g/L，玉米淀粉10-25g/L，硫酸镁0.1-1g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，pH5-7。
4.根据权利要求1所述的地顶孢霉培养物，其特征在于，步骤S3中所用地顶孢霉的发酵培养基，由以下成分及其含量：蔗糖5-20g/L，葡萄糖20-55g/L，蛋白胨10-20g/L，酵母粉10-20g/L，玉米淀粉20-40g/L，硫酸镁0.1-1g/L，磷酸二氢钾0.1-1g/L，磷酸氢二钾0.1-2g/L，硫酸铵0.001-0.1g/L，保护剂5-10g/L，混合剂10-20g/L。
5.根据权利要求4所述的地顶孢霉培养物，其特征在于，所述保护剂由聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖按重量比1-3:1-2:3-5组成；所述混合剂由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土按重量比2-3:1-4:2-3组成。
6.根据权利要求1-5所述地顶孢霉培养物在制备缓解视疲劳药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物由地顶孢霉培养物单独或与其它缓解视疲劳药物或与其它活性化合物，与制剂允许的赋形剂或载体制成液体制剂；所述其它活性化合物选用中药活性物质、人工合成化合物和体内活性物质。
权 利 要 求 书1/1页CN 107475132 A
一种地顶孢霉培养物及其应用
技术领域
[0001]本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种地顶孢霉培养物在及其应用。
背景技术
[0002]视疲劳是目前眼科常见的一种疾病，患者的症状多种多样，常见的有近距离工作不能持久，出现眼及眼眶周围疼痛、视物模糊、眼睛干涩、流泪等，严重者头痛、恶心、眩晕。它不是独立的疾病，而是由于各种原因引起的一组疲劳综合征。其发生原因也是多种多样的，常见的有：(l)眼睛本身的原因，如近视、远视、散光等屈光不正、调节因素、眼肌因素、结膜炎、角膜炎、所戴眼镜不合适等；(2)全身因素，如神经衰弱、身体过劳、癔病或更年期的妇女；(3)环境因素，如光照不足或过强，光源分布不均匀或闪烁不定，注视的目标过小、过细或不稳定等。由上述可见，产生视疲劳的原因复杂多样，视疲劳是由于不良作业环境、视觉器官功能障碍、全身器质性疾病及心理异常等诸多因素单一或相互作用所致的视作业不能正常进行的一组征候。目前市场上已经推出了多种可改善视力、缓解视疲劳的药物，但综合效果不佳。
[0003]地顶孢霉(Acremonium terricola)培养物是由从古尼虫草分离的地顶孢霉经人工发酵而得到的产品， 拥有虫草素、虫草酸、多糖、甾醇和氨基酸等活性成分。现有研究表明，虫草多糖是为高度分枝的杂多糖，主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖等单糖组成，也是虫草类的主要活性成分之一。虫草多糖是虫草中最主要的药理活性成分之一，优选高效虫草源地顶孢霉，通过深层发酵方法从中获取多糖组份，改变了以往主要从资源稀缺的野生子实体中提取有效生物活性物质的局面，已成为当前开发人工虫草保健品的重要手段。虫草酸能抑制各种病菌的成长，可预防与脑血栓、脑出血、心肌梗塞、长期衰竭；虫草酸含量的高低也是衡量虫草质量的主要标准之一。
[0004]虫草素具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、免疫调节等生物活性，主要作用机制是替代腺苷参与了细胞代谢过程，抑制mRNA加尾，虫草素5’三磷酸连至mRNA的3’端，因缺少3’-OH 而导致了mRNA无法延伸，mRNA无法成熟，最终抑制肿瘤细胞或病原细胞的生长。
[0005]而目前，将地顶孢霉培养物应用制备缓解视疲劳药物的用途尚无报道。
发明内容
[0006]本发明的目的在于，提供一种地顶孢霉培养物及其应用。
[0007]本发明通过以下技术方案实现：
[0008]一种地顶孢霉培养物，其制备方法为：
[0009]S1.将地顶孢霉接种到斜面培养基中，于25-28℃培养4-5天，制得斜面试管菌种；[0010]S2.将步骤S1制得的斜面试管菌种进行摇瓶培养，然后移至种子罐中进行种子培养，25-35℃，200-250rpm，培养20-50h，得种子培养液；
[0011]S3.将步骤S2制备得到的种子培养液按接种量20-25％接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中pH控制为5-7，培养温度控制在25-27℃，搅拌转速控制在110-
130r/min，溶氧浓度控制在30％以上，发酵培养10h后向发酵罐中加入1.5g/L腺苷后，发酵20-30h；
[0012]S4.将步骤S3得到的发酵液，进行超滤膜过滤、喷雾干燥即得。
[0013]进一步地，步骤S1中所用斜面培养基为马铃薯150-200g/L，葡萄糖15-25g/L，水1000mL，琼脂粉20g/L，pH6-7。
[0014]进一步地，步骤S2中所用种子培养基为：蔗糖30-50g/L，蛋白胨5-10g/L，酵母粉5-10g/L，玉米淀粉10-25g/L，硫酸镁0.1-1g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，pH5-7。
[0015]进一步地，步骤S3中所用地顶孢霉的发酵培养基，由以下成分及其含量：蔗糖5-20g/L，葡萄糖20-55g/L，蛋白胨10-20g/L，酵母粉10-20g/L，玉米淀粉20-40g/L，硫酸镁0.1-1g/L，磷酸二氢钾0.1-1g/L，磷酸氢二钾0.1-2g/L，硫酸铵0.001-0.1g/L，保护剂5-10g/L，混合剂10-20g/L；
[0016]进一步地，所述保护剂由聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖按重量比1-3:1-2:3-5组成；所述混合剂由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土按重量比2-3:1-4:2-3组成。[0017]所述地顶孢霉在制备缓解视疲劳药物中的应用。
[0018]所述药物由地顶孢霉培养物单独或与其它缓解视疲劳药物或与其它活性化合物，与制剂允许的赋形剂或载体制成液体制剂；所述其它活性化合物选用中药活性物质、人工合成化合物和体内活性物质。
[0019]本发明的药学上可接受的载体包括但不限于以下：
[0020]稀释剂：淀粉、糖粉、乳糖、糊精、微晶纤维素、无机盐、糖醇类等。
[0021]润湿剂与粘合剂：纯化水、乙醇、明胶、聚乙二醇、纤维素衍生物等。
[0022]崩解剂：淀粉、羧甲基淀粉钠、纤维素衍生物、交联聚维酮等。
[0023]润滑剂：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、聚乙二醇等。
[0024]助溶剂：水、乙醇、甘油、丙二醇、液状石蜡、植物油等。
[0025]矫味剂：蔗糖、单糖、芳香剂等。
[0026]防腐剂：苯甲酸、山梨酸、甲酯、乙酯、丙酯等。
[0027]本发明地顶孢霉培养物能够有效改善眼胀、眼痛、畏光、视物模糊、眼睛干涩及视力下降等视疲劳症状；本发明地顶孢霉培养物生产成本低、易于大规模获得，极为有利于顶孢霉培养物在制备缓解视疲劳药物中的应用。
具体实施方式
[0028]下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。[0029]本发明所用玉米淀粉购于临沂恒源实业有限公司；蚯蚓粉购于陕西迪隆生态环保技术有限公司；发芽糙米购于广州市里阳食品有限公司；耕土源于华南农业大学试验田，其它药品均购于国药集团化学试剂有限公司。
[0030]实施例1 一种地顶孢霉培养物的制备方法
[0031]所述地顶孢霉培养物的制备方法，包括下述步骤：
[0032]S1.将地顶孢霉接种到斜面培养基中，于25℃培养4天，制得斜面试管菌种；所用斜面培养基为马铃薯150g/L，葡萄糖15g/L，水1000mL，琼脂粉20g/L，pH6；
[0033]S2.将步骤S1制得的斜面试管菌种进行摇瓶培养，然后移至种子罐中进行种子培养，25℃，200rpm，培养20h，得种子培养液；所用种子培养基为：蔗糖30g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，玉米淀粉10g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾1g/L，pH值为5；
[0034]S3.将步骤S2制备得到的种子培养液按接种量20％接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中pH控制为5，培养温度控制在25℃，搅拌转速控制在110r/min，溶氧浓度控制在30％以上，发酵培养10h后向发酵罐中加入1.5g/L腺苷，然后继续发酵至20h；所述地顶孢霉的发酵培养基，由以下成分及其含量组成：蔗糖5g/L，葡萄糖55g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，玉米淀粉40g/L，硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸铵0.1g/L，保护剂5g/L，混合剂10g/L；
[0035]所述保护剂由聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖按重量比1:1:3组成；所述混合剂由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土按重量比2:1:2组成。
[0036]S4.将步骤S3得到的发酵液，进行超滤膜过滤、喷雾干燥即得。
[0037]实施例2 一种地顶孢霉培养物的制备方法
[0038]所述地顶孢霉培养物的制备方法，包括下述步骤：
[0039]S1.将地顶孢霉接种到斜面培养基中，于28℃培养5天，制得斜面试管菌种；所用斜面培养基为马
铃薯200g/L，葡萄糖25g/L，水1000mL，琼脂粉20g/L，pH值为7；
[0040]S2.将步骤S1制得的斜面试管菌种进行摇瓶培养，然后移至种子罐中进行种子培养，35℃，250rpm，培养50h，得种子培养液；所用种子培养基为：蔗糖50g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，玉米淀粉25g/L，硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾5g/L，pH值为7；
[0041]S3.将步骤S2制备得到的种子培养液按接种量25％接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中pH值控制为7，培养温度控制在27℃，搅拌转速控制在130r/min，溶氧浓度控制在30％以上，发酵培养15h后向发酵罐中加入3g/L腺苷，然后继续发酵至30h；所述地顶孢霉的发酵培养基，由以下成分及其含量组成：蔗糖20g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/ L，酵母粉20g/L，玉米淀粉40g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，硫酸铵0.001g/L，保护剂10g/L，混合剂20g/L；
[0042]所述保护剂由聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖按重量比3:2:5组成；所述混合剂由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土按重量比3:4:3组成。
[0043]S4.将步骤S3得到的发酵液，进行超滤膜过滤、喷雾干燥即得。
[0044]实施例3 一种地顶孢霉培养物的制备方法
[0045]所述地顶孢霉培养物的制备方法，包括下述步骤：
[0046]S1.将地顶孢霉接种到斜面培养基中，于27℃培养5天，制得斜面试管菌种；所用斜面培养基为马铃薯175g/L，葡萄糖20g/L，水1000mL，琼脂粉20g/L，pH值为6.5；
[0047]S2.将步骤S1制得的斜面试管菌种进行摇瓶培养，然后移至种子罐中进行种子培养，30℃，220rpm，培养30h，得种子培养液；所用种子培养基为：蔗糖45g/L，蛋白胨8g/L，酵母粉8g/L，玉米淀粉15g/L，硫酸镁0.7g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，pH值为6.5；
[0048]S3.将步骤S2制备得到的种子培养液按接种量23％接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中pH控制为6.5，培养温度控制在26℃，搅拌转速控制在120r/min，溶氧浓度控制在30％以上，发酵培养12h后向发酵罐中加入2g/L腺苷，然后继续发酵至25h；所述地顶孢霉的发酵培养基，由以下成分及其含量组成：蔗糖12g/L，葡萄糖35g/L，蛋白胨15g/
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