(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010637646.6
(22)申请日 2020.07.05
(71)申请人 浙江大学
地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘
路866号浙江大学紫金港校区医学院
科研楼A209
(72)发明人 钱鹏旭 王辉 韩颖丽
(74)专利代理机构 北京太兆天元知识产权代理
有限责任公司 11108
代理人 王宇
(51)Int.Cl.
C12N 5/078(2010.01)
C12N 5/09(2010.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种分离纯化真核细胞80S核
糖体并用于体外翻译的方法。所分离的核糖体结
构完整，颗粒均一，可观察到核糖体大小亚基、
mRNA通道等核糖体重要结构。该方法适用于体外
培养的细胞系以及原代骨髓单核细胞。体外培养
细胞系HL60中所分离核糖体翻译活性稍高于小
鼠骨髓细胞中核糖体。同时，利用该方法检测到
敲除SNORD113‑114基因簇的小鼠骨髓细胞核糖
体翻译活性显著降低，与其它方法所得到的实验
结论一致。权利要求书1页 说明书6页 附图4页CN 112111452 A 2020.12.22
C N 112111452
A
1.一种分离纯化真核细胞80S核糖体的方法，其特征在于包括以下步骤：1)裂解细胞；
2)分离纯化细胞裂解液中的核糖体；
其特征在于1)所述的裂解细胞在溶液A中进行，所述的溶液A含有蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂以及DTT，并且不含K +和Mg 2+。
2.如权利要求1所述的分离纯化真核细胞80S核糖体的方法，其特征在于核酸酶抑制剂工作浓度为5U/μL；DTT终浓度为1mM。
3.如权利要求1所述的分离纯化真核细胞80S核糖体的方法，其特征在于步骤2)采用离心法去除细胞核以及线粒体等细胞器成分，最大程度分离纯净核糖体颗粒。
4.如权利要求1-3中任一项所述的分离纯化真核细胞80S核糖体的方法，其特征在于：所述步骤1)包括无血清培养基处理细胞20小时，离心获得细胞沉淀，向细胞沉淀中溶液A，重悬细胞，将此细胞悬液至于冰上30分钟，期间每5分钟震荡一次。
5.如权利要求1-3中任一项所述的分离纯化真核细胞80S核糖体的方法，其特征在于：所述步骤2)包括将细胞裂解液离心，将上清小心加至蔗糖垫液上，离心，并用溶液A漂洗沉淀，然后加入溶液A，于冰上溶解，最后离心去除不能溶解的沉淀，所得溶液即为核糖体溶液，所述蔗糖垫液由蔗糖粉末溶于溶液A配置而成，浓度为1M，所述的溶液A用纯净水、蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂以及DTT配制而成。
权 利 要 求 书1/1页CN 112111452 A
一种分离纯化真核细胞核糖体并用于体外翻译的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种分离纯化真核细胞核糖体并用于体外翻译的方法。
背景技术
[0002]核糖体是真核生物中至关重要的细胞器，目前有研究表明包括核糖体在内的真核生物蛋白翻译系统在调控基因表达过程中起到重要的作用。近期研究表明，细胞内存在异质性核糖体亚(specialized ribosomes)，核糖体之间组成成分以及功能都不尽相同，导致各自对于不同mRNA的翻译具有偏好性。这种核糖体异质性可能出现在同一细胞内的不同核糖体间，也可能存在于不同组织、细胞中的核糖体之间，因此对于组织、器官的形成以及正常功能具有调控作用。除此之外，一些疾病中，如癌症以及其他非癌症疾病，都已发现核糖体功能或组成异常，这些疾病统称为“核糖体病”。DBA(Diamond-Blackfan anemia)、先天性角化不良、5q综合征(5q-syndrome)都属于核糖体病，并且目前仍缺乏有效的手段。鉴于此，分离纯化核糖体技术有助于此类疾病的研究，并为开发相关药物于方法提供研究基础。
[0003]无细胞蛋白合成/翻译系统(Cell free protein synthesis systems，CFPS)用于体外蛋白合成系统已有几十年历史，主要用于大量获得医药用途蛋白质类，如疫苗、生长因子等。由于不存在细胞壁、细胞膜阻碍，体外翻译体统能够更加方便地获取蛋白产物，并用于药物筛选等用途。mRNA加工成熟、翻译、降解以及miRNA调控等众多生理过程相关研究成果都来源于体外翻译系统。目前应用最多的体外翻译系统是兔网织红细胞裂解液(Rabbit reticul ocyte lysate，RRL)系统，最早由Hunt和Jackson在1974年研发成功。后来经过改进，利用S7核酸酶(S7 micrococcal nuclease)去除内源mRNA，能够更有效地对外源mRNA进行翻译，提高目的蛋白产率，目前两种系统都在应用于不同用途中。
[0004]本发明提供一种分离纯化真核细胞80S核糖体的方法，并将所分离核糖体用于体外翻译反应。借助RRL系统，将其内源核糖体通过超速离心去除干净，经测试处理后的RRL翻译活性可忽略不计。利用此经过处理的RRL系统，测试发现所分离核糖体具有翻译外源luciferase mRNA活性。经透射电镜检测，本方法所分离的核糖体结构完整，大小亚基结合紧密，同时能够观察到mRNA通道等重要功能区域。同时，利用本方法分离纯化体外培养细胞系(HL60)以及小鼠骨髓原代细胞中的核糖体同样具有翻译活性。最后，利用本发明方法检测到敲除SNORD113-114基因簇后，小鼠骨髓细胞中的核糖体翻译功能显著受损，所得结论与其他方法一致，表明本方法具有足够高的灵敏度。经检索，目前亦没有类似分离纯化真核生物80S核糖体并用于体外翻译相关方法的专利申请。
发明内容
[0005]本发明提供了一种分离纯化真核细胞80S核糖体的方法，步骤如下：
[0006](1)制备细胞裂解液
[0007]对于体外培养细胞系来说，首先将细胞培养基更换为无血清培养基，培养20小时。之后计数并取108个细胞，200g离心5分钟，弃去上清后获得细胞沉淀。利用4℃遇冷PBS缓冲液将细胞沉淀重悬，并再次离心获得细胞沉淀。
[0008]向细胞沉淀中加入4倍于沉淀体积溶液A，利用移液吹打重选细胞至无明显结块。将此细胞悬液至于冰上30分钟，期间每5分钟震荡一次。
[0009]之后取10μL细胞悬液，用台盼蓝染并于显微镜下观察细胞裂解情况。如果观察到全部细胞都变蓝，同时能观察到圆形的细胞状态，说明已经裂解充分。
[0010]若需分离原代小鼠骨髓细胞核糖体，首先利用二氧化碳麻醉并颈椎脱臼处死小鼠，剥离胫骨和腓骨，利用注射器将骨髓腔中骨髓冲出，并吹散重悬于5mL的PBS+2％FBS溶液中。于1500rpm离心5min，弃上清并将细胞沉淀重悬于3mL红细胞裂解液中，于37℃裂解5min，之后加入4mL的PBS+2％FBS终止反应，离心后重悬于PBS+2％FBS中并用滤网过滤去除杂质团块。最后将所得细胞悬液按照与细胞系相同处理方式裂解细胞。
[0011](2)分离纯化细胞裂解液中的核糖体
[0012]将上述细胞裂解液于4℃条件下20,000g离心10分钟，将上清转移至新的离心管中，弃去沉淀。接下来将上清小心加至蔗糖垫液上，于4℃以240,000g离心2.5小时。然后弃上清，用溶液A轻轻漂洗沉淀一次，最后加入50μL溶液A，于冰上溶解1小时，期间每10分钟轻轻震荡离心管，促进溶解。最后于4℃以20,000g离心10分钟，去除不能溶解的沉淀，所得溶液即为核糖体溶液。
[0013]所述PBS为商品化磷酸盐缓冲液(生工生物)，不含钙离子、镁离子。FBS为商品化胎牛血清(Gibco)。蔗糖垫液浓度为1M，由蔗糖粉末溶于溶液A配置而成，需用2μm滤器过滤除菌。溶液A用无核酸酶的PCR级纯净水、蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂以及DTT配制而成，其中蛋白酶抑制剂为进口商品化试剂(罗氏)，原始蛋白酶抑制剂溶液按照最终溶液A体积的1/ 100加入A中并充分混匀；核酸酶抑制剂为国产商品化试剂(诺维赞)，工作浓度为5U/μL；DTT 终浓度为1mM。红细胞裂解液为商品化试剂(索莱宝生物)。
[0014]体外翻译反应采用商品化试剂盒(Promega)。实验步骤如下：
[0015]将试剂盒中RRL(Rabbit reticulocyte lysate)于冰上融化，将上清于4℃以170, 000g离心4小时，移除核糖体，上清(uRRL)转移至新的离心管中。按照20μL一管分装冻存于-80℃冰箱中，沉淀重悬于溶液A中，5μL一管分装冻存。
[0016]将上述uRRL以及分离纯化的核糖体按照如下反应体系配制反应液：
[0017]
[0018]将反应液于30℃反应1小时，之后加入等体积luciferase底物，测定反应液中荧光值，以此作为核糖体翻译活性表征指标。
[0019]经检测发现所分离核糖体具有翻译外源luciferase mRNA活性。经透射电镜检测，本方法所分离的核糖体结构完整，大小亚基结合紧密，同时能够观察到mRNA通道等重要功
能区域。同时，利用本方法分离纯化体外培养细胞系(HL60)以及小鼠骨髓原代细胞中的核糖体同样具有
翻译活性。最后，利用本发明方法检测到敲除SNORD113-114基因簇后，小鼠骨髓细胞中的核糖体翻译功能显著受损，所得结论与其他方法一致，表明本方法具有足够高的灵敏度。
[0020]与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0021] 1.本发明方法中裂解细胞所用的低渗裂解液(溶液A)不含K+,Mg2+等影响核糖体结构与功能的成分。经测试，多余上述离子对于体外翻译反应具有显著的抑制作用。同时，该溶液A中含有蛋白酶抑制剂、RNA酶抑制剂以及DTT，防止蛋白酶、核酸酶对于核糖体蛋白的降解，DTT提供还原性溶液环境，避免蛋白、核酸的氧化作用，最大限度保留核糖体的结构、功能完整性。
[0022] 2.本发明所述方法利用两步离心去除细胞核以及线粒体等细胞器成分，最大程度分离纯净核糖体颗粒。所用的蔗糖垫液由溶液A配置，并且利用滤器去除可能存在的细菌污染，确保离心过程中核糖体结构完整。经检测蔗糖溶液同样具有抑制体外翻译反应效果，因此获得核糖体沉淀后，需用溶液A轻轻漂洗沉淀，避免蔗糖残留。
[0023] 3.本发明所述方法分离纯化的核糖体结构功能完整。经电子显微镜检测，所得核糖体颗粒结构完整，大小均一，可观察到大小亚基、mRNA通道等重要功能区域。利用RRL体外翻译系统检测表明，从HL60细胞系或小鼠骨髓细胞中分离的核糖体均具有翻译荧光素酶mRNA功能。
[0024] 4.利用本发明所述分离纯化核糖体方法以及体外翻译系统，检测发现敲除SNORD113-114基因簇的小鼠骨髓细胞中核糖体翻译功能显著降低。
附图说明
[0025]图1为利用透射电镜检测所分离核糖体结构；
[0026]图2为利用RRL体外翻译系统检测HL60细胞系以及小鼠骨髓细胞中分离的核糖体翻译活性；
[0027]图3为中利用SUnSET反应检测野生型以及敲除SNORD13-114基因簇小鼠中骨髓细胞翻译活性；
[0028]图4为利用Polysome Profiing方法检测野生型以及敲除SNORD13-114基因簇小鼠中骨髓细胞翻译活性；
[0029]图5为利用OP-Puro检测试剂盒结合流式细胞术检测小鼠骨髓细胞中四种HSC翻译活性，并对比野生型以及敲除SNORD13-114基因簇小鼠中骨髓细胞翻译活性；
[0030]图6为来利用RRL体外翻译系统检测野生型以及敲除SNORD13-114基因簇小鼠中骨髓细胞翻译活性；
具体实施方式
[0031]下面结合附图与实施例对本发明作进一步的说明。
[0032]实施例1：利用投射电镜检测所分离核糖体结构完整性。
[0033]首先利用本发明所述方法分离纯化HL60核糖体。将HL60细胞培养基更换为无血清培养基，处理20小时。之后计数并取108个细胞，200g离心5分钟，弃去上清后获得细胞沉淀。
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