[19]
中华人民共和国专利局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1155582A [43]公开日1997年7月30日
[21]申请号96100703.6[22]申请日96.1.25
[71]申请人中国预防医学科学院病毒学研究所
地址100052北京市宣武区迎新街100号
[72]发明人刘文军 朱既明 阮力 杨芙蓉 任贵方 [74]专利代理机构三高专利事务所代理人江崇玉
[51]Int.CI 6C12N 15/52C12N 15/63C12N 5/06
权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 3 页
[54]发明名称
[57]摘要 本发明提供一种利用CHO dhfr -细胞的谷氨酰
胺合成酶(GS)基因作为扩增基因组建的表达乙肝病
能高效分泌乙肝病毒表面抗原S蛋白的哺乳动物细
胞系G4。在本发明的质粒结构中所用扩增基因和选
择标记基因GS基因来源于CHOdhfr -细胞，在表达质
粒的结构中，乙肝病毒表面抗原S基因受0.75Kb大
小的CMV-IE启动子的调控，GS基因受SV40早期启动
子的调控。用该质粒转化的CHO-KI细胞能够高效分
泌乙肝病毒表面抗原S蛋白。
96100703.6权 利 要 求 书第1/1页 1、一种可用于扩增的谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于所有的质粒
结构中的GS基因来源于CHOdhfr-细胞，且该GS基因的核苷酸序列与来源于CHO-K1细胞的GS基因的序列其895位碱基由乌嘌呤G变为胞嘧淀C，并导致299位氨基酸由苷氨酸变为精氨酸。
2、一种含有表达乙肝病毒表面抗原S基因的重组质粒P M SG，其特征在于质粒结构中包括CMV-IE075K b启动子及其控制之下的乙肝病毒表面抗原S基因和SV40早期启动子及其控制之下的谷氨酰胺合成酶(GS)基因。
3、根据权利要求2的重组质粒，其特征在于所说的乙肝病毒表面抗原S基因在前，GS基因在后。
4、根据权利要求2-3中的任何一个重组质粒，其特征在于所有的质粒结构中的G S基因来源于C H O d h f r-细胞。
5、根据权利要求1-3中的任何一个重组质粒，其特征在于G S蛋白编码基因在此质粒中作为扩增和选择标记基因。
6、根据权利要求1-4中的任何一个重组质粒，其特征在于所说的乙肝病毒表面抗原S基因是乙肝病毒基因组的X h o I-BglII片段，此DNA片含有乙肝病毒表面抗原S基因、乙肝病毒基因组增强子1(Eh1)和增强2(Eh2)、X基因。
7、根据权利要求1-5中的任何一个重组质粒，其特征在于所说的乙肝病毒是adr亚型。
8、一种能分泌乙肝病毒面抗原S蛋白的细胞系G4，其特征在于它是利用权利要求1-7中任何一个权利要求的重组质粒转化的哺乳动物细胞系，此哺乳动物细胞是C H O-K1细胞。
96100703.6说 明 书第1/10页高效表达乙肝表面抗原的转基因细胞系
本发明涉及一种可用于扩增的谷氨酰胺合成酶基因，是一种高效表达乙肝表面抗原的转基因细胞系，属于生物技术基因表达或遗传工程领域。
乙型肝炎病毒(HBV)是引起遍及世界的慢性肝病和肝癌的常见病因。我国是乙型肝炎的高发区，有50-70％的人感染过乙肝，8-10％的人(约一亿人)为带毒者。目前还没有乙肝的有效方法，接种乙肝疫苗是预防肝炎的有效措施。
血源疫苗已投入生产使用，但不能满足普遍的预防接种的需要。由于血源疫苗存在一些问题，如血源有限、带有肯定的潜在性危险(包括丙肝、艾滋病等)，因此需要急切研究基因工程疫苗。美国Merck公司研制的酵母基因工程乙肝疫苗早在1986年就获得FDA的批准而投入生产。我国利用哺乳动物细胞表达的乙肝基因工程疫苗也获准生产，但用于生产的细胞株的表达水平与酵母系统的表达水平相比，仍相对较低。哺乳动物细胞分泌的HBsAg颗粒具有免疫原性强、抗原提纯简单和适于连续性大规模的培养的优点。为此有必要发展新的高表达细胞系，以进一步提高乙肝病毒表面抗原在哺乳动物细胞中表达水平。近年来，乙肝基因工程疫苗特别是乙肝表面抗原蛋白在哺乳动物细胞中表达的研究主要获得以下进展：
自1980年，D e b o i s(1)等首先报道使用双拷贝H B V初级克隆质粒转化小鼠LTK-细胞成功表达HBsAg以来，由于哺乳动物细胞
具有分泌、糖化、可连续培养的优点，国内外学者应用基因工程技术在哺乳动物细胞中表达HBsAg方面作了大量的工作。为了提高HBsAg在哺乳动物细胞中的表达水平，早期表达HBsAg时，主要应用H B V自身的启动子，进而使用S V40早期启动子、摄金蛋白( metallothionein)启动子等功能更强的启动子(2-6)。在转化选择标记方面，先后使用过HSV-tk、m-dhfr、Neo、Eco-gpt、mMT (1-3、5-8)等。在扩增基因方面，主要使用了m-dhfr(2-4)和BPV(5，6，9)，都获得了较好的扩增效果。在表达的宿主方面，小鼠LTK-细胞(1)、小鼠乳头瘤C-127细胞(5，6)、小鼠NIH3T3细胞(9)，绿猴Vero细胞(10-12)，CV-1细胞(8)，COS细胞[13，14]和中华地鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺失型(CHOdhfr-[2，15]等传代细胞都获得不同程度表达HBsAg的细胞系。
在国内，1983年阮力等首先报道(16)分别用ayw和adw亚型的乙肝病毒HBV全基因组表达质粒，与HSV-tk基因一起导入LTK-细胞。 基重组质粒的特点是：乙肝表面抗原基因由本身启动子的调控，而选择基因HSV-tk基因存在于另一质粒中。两种质粒必须共转化才能选出阳性克隆。
表达系统：采用缺失胸苷激酶基因的营养缺陷型小鼠传代细胞(LTK-)作为其表达系统。
用AUSRIA试剂盒检测细胞培养液中的HBSAg表达量为2.5ug/ 106细胞/瓶。
免疫电镜可见到22nm的HBsAg。
1985年，任贵方等报道(3)，分别用HBVayw亚型和adr亚型基
因组DNA BglII片段构建成四种表达乙肝表面抗原的重组质粒。 此四种重组质粒的特点是：乙肝病毒表面抗原受其本身的启动子的调控，而二氢叶酸还原酶(dhfr)基因受SV40早期启动子的调控。
表达系统：采用缺失胸苷激酶基因的营养缺陷型小鼠传代细胞(LTK-)作为宿主细胞，用AUSRIA试剂盒检测细胞培养液中的HBsAg分泌量为12.5ug/107细胞/天。
1991年，任贵方等报道(17)，用adr亚型的乙肝病毒表面抗原(H B s A g)主蛋白基因构建重组质粒(p S V2D H B R1-327.2K b)。 此重组质粒的特点是：含有两个SV40启动子，乙肝表面抗原受SV40早期启动子的控制，而dbhfr基因受另一个SV40启动子的调控，且乙肝表面抗原基因在前，dhfr基因在后。
表达系统：任贵方等采用二氢叶酸还原酶(dhfr)基因缺陷型的中国地鼠卵巢细胞(C H O d h f r-)作为其表达系统的宿主细胞。 表达产物的检测：
1)电镜下观察，可见22nm大小的HBsAg颗粒。
2)SDS-PAGE电泳显示：可见到23KD，27KD，30KD三条蛋白带。
3)用A U S I A试剂盒检测细胞培养液中H B s A g的表达产量，其中一株细胞B43细胞系的表达产量为3.75ug/105细胞/2天。此细胞株即我国已批准用于生产的表达H B s A g的高效表达细胞系。 以上所介绍的乙肝病毒表面抗原主蛋白基因在哺乳动物细胞中的表达虽然取得较大的进展，特别是任贵方等所作的工作得到了可用于生产的细胞株，表达产量也是在现有报导中最高的。但在表达乙肝表面抗原重组质粒的构建及其表达系统的选择方面存
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