(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010789394.9
(22)申请日 2020.08.07
(71)申请人 武汉科前生物股份有限公司
地址 430206 湖北省武汉市东湖新技术开
发区高新二路419号
(72)发明人 张华伟 孙芳 徐高原 周明光
曾小燕 朱娴静 郝根喜 邵伟
(74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限
公司 11002
代理人 钱云
(51)Int.Cl.
C07K 19/00(2006.01)
C12N 15/62(2006.01)
C12N 15/866(2006.01)
A61K 39/12(2006.01)
A61K 39/385(2006.01)A61K 47/64(2017.01)A61P 31/14(2006.01) (54)发明名称
应用
(57)摘要
领域，具体公开了一种猪蓝耳病亚单位疫苗及其
白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，接着提供
一种猪蓝耳病亚单位疫苗，其包括所述融合蛋
行密码子优化后的PRRSV NADC30‑like毒株的
ORF5全长基因与去除Domain Ⅲ结构域的绿脓杆
菌的基因融合表达，利用昆虫杆状病毒/昆虫细
胞表达系统来获得的。本发明疫苗的保护效果
好，能够诱导有效的体液免疫和细胞免疫，适合
用于临床对蓝耳病的预防。权利要求书1页 说明书8页序列表4页 附图2页CN 111978411 A 2020.11.24
C N 111978411
A
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种融合蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.含有权利要求2所述的编码基因的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。
4.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述的编码基因或权利要求3所述的生物材料在制备猪蓝耳病亚单位疫苗中的应用。
5.猪蓝耳病亚单位疫苗，其特征在于，所述猪蓝耳病亚单位疫苗的有效成分为权利要求1所述的融合蛋白。
6.权利要求5所述的猪蓝耳病亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的融合蛋白与佐剂混合的步骤。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白的制备方法包括：
(1)将PRRSV NADC30-like毒株的ORF5全长基因序列进行密码子优化；
(2)将去除Domain Ⅲ结构域的绿脓杆菌外毒素A的基因序列与优化后的所述ORF5全长基因序列串联，加His标签和酶切位点，合成所述融合蛋白的基因序列。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白的制备方法还包括：
(3)将合成的所述融合蛋白的基因序列连入昆虫杆状病毒表达载体中，转化大肠杆菌感受态，提取重组穿梭载体；
(4)将提取的所述重组穿梭载体转染到昆虫细胞中，获得重组杆状病毒；
(5)将获得的所述重组杆状病毒接种于昆虫细胞中，收获并纯化目的蛋白。
权 利 要 求 书1/1页CN 111978411 A
一种猪蓝耳病亚单位疫苗及其制备方法与应用
技术领域
[0001]本发明涉及基因工程领域及兽医生物制药领域，具体地说，涉及一种猪蓝耳病亚单位疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
[0002]猪繁殖与呼吸综合征是PRRSV引起的高度传染性的疾病，能够引起母猪繁殖障碍、各年龄段猪呼吸道症状、仔猪高死亡率等，是造成养猪业严重经济损失的重要疾病之一。目前市场上针对该病防疫的疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗。灭活疫苗安全性高但不能很好地诱导细胞免疫，弱毒疫苗免疫保护效果良好但存在散毒和返强风险。而亚单位疫苗预期能够起到较好的预防作用。
[0003]新发流行毒株NADC30-like，可引起猪场免疫猪蓝耳病发病，相比高致病性PRRSV，NADC30-like毒力相对温和，能够引起经典毒株的致病症状和30％-50％的死亡率，其基因序列上与美国NADC30毒株高度同源，也因此得名NADC30-like。现市场上并无针对该毒株的相关疫苗，已有的蓝耳病疫苗并不能对该毒株引起的蓝耳病爆发起到很好的防御作用。[0004]PRRSV基因组包含8个开放阅读框，编码的重要结构蛋白主要是ORF5、ORF6、ORF7，分别编码GP5蛋白(又名E蛋白)、M蛋白和N蛋白。GP5蛋白不仅能同时诱导细胞免疫应答和体液免疫应答。而且在蛋白的表面还带有中和位点。但GP5蛋白是PRRSV的主要囊膜糖蛋白，是变异性最明显的蛋白之一，欧洲株和北美株基因亚型之间的序列同源性只有51％-55％，即使在同一个基因亚型毒株之间，同源性也仅为94％左右。因此，针对不同的毒株，需要有针对性的研究相关疫苗。
[0005]现有技术中已有的猪蓝耳病疫苗设计方案有：“能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗(申请号201610333073.1)”、“一种蓝耳病亚单位疫苗的制备(申请号201310190308.2)”和“重组质粒、重组病毒载体、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及含有该蛋白的亚单位疫苗(申请号201510257656.6)”。以它们思路所设计的疫苗对于机体细胞免疫反应的刺激仍有待进一步提升。
[0006]因此，有必要对猪蓝耳病亚单位疫苗的构建进行进一步研究。
发明内容
[0007]针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种保护效果良好，适合用于临床对猪蓝耳病预防的疫苗。
[0008]为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
[0009]本发明首先提供一种融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0010]本发明还提供一种融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。该编码基因编码上述融合蛋白。
[0011]本发明另提供一种含有上述编码基因的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。
[0012]本发明又提供一种上述融合蛋白或编码基因或生物材料在制备猪蓝耳病亚单位疫苗中的应用。
[0013]本发明再提供一种猪蓝耳病亚单位疫苗，其有效成分为上述融合蛋白。
[0014]本发明还提供一种猪蓝耳病亚单位疫苗的制备方法，其包括将上述融合蛋白与佐剂混合的步骤。
[0015]其中，所述融合蛋白的制备方法包括：
[0016](1)将PRRSV NADC30-like毒株的ORF5全长基因序列进行密码子优化；
[0017](2)将去除DomainⅢ结构域的绿脓杆菌外毒素A的基因序列与优化后的所述ORF5全长基因序列串联，加His标签和酶切位点，合成所述融合蛋白的基因序列。
[0018]所述融合蛋白的制备方法还包括：
[0019](3)将合成的所述融合蛋白的基因序列连入昆虫杆状病毒表达载体中，转化大肠杆菌感受态，提取重组穿梭载体；
[0020](4)将提取的所述重组穿梭载体转染到昆虫细胞中，获得重组杆状病毒；[0021](5)将获得的所述重组杆状病毒接种于昆虫细胞中，收获并纯化目的蛋白。[0022]本发明中的猪蓝耳病亚单位疫苗中采用的GP5蛋白的核苷酸序列(ORF5全长基因)来源于新发流行毒株PRRSV NADC30-like，可针对该毒株引起的疾病暴发起到预防作用。而由于不同毒株的GP5蛋白会表现出不同的N糖基化位点，且这些位点的变化将对相应的免疫反应产生不可简单预期的影响，故而现有毒株的疫苗设计思路并不一定能简单套用到新毒株的疫苗研发中，因此，本发明针对PRRSV NADC30-like这一毒株的特性，对其疫苗构建进行了反复研究，最终才获得本发明所记载的效果理想的针对性疫苗。
[0023]绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A，PEA)是绿脓杆菌感染的毒性因子，具有4个功能结
构域，Domain Ia、Ib、Ⅱ和Ⅲ。其中Domain Ia是细胞结合功能区，DomainⅡ是转位功能区，Domain Ib和DomainⅢ的末端氨基酸位点为ADP核糖基化活性区，即毒性结构域。本发明是将PEA的DomainⅢ毒性结构域去除后(PEA △DⅢ)与特定病原的免疫原性区域结合，表达出重组蛋白(PEA△DⅢ-GP5)，经纯化、乳化制备成亚单位疫苗后免疫机体，从而刺激机体产生更强的特异性细胞免疫反应，进而提高了亚单位疫苗的保护效果。[0024]本发明中亚单位疫苗为GP5全蛋白序列，源自流行毒株PRRSV NADC30-like，且包含绿脓杆菌外毒素蛋白PEA的转位结构域，相比只含有病毒抗原蛋白的亚单位疫苗，本疫苗能够更好的刺激机体对PRRSV的体液免疫和细胞免疫应答。且本发明中的融合蛋白为分泌型蛋白，无需经历翻译后修饰和内质网滞留的过程，可直接分泌到细胞外，纯化过程更为简便。
[0025]进一步的，本发明所制备的亚单位疫苗含有猪繁殖与呼吸系统综合征病毒PRRSV NADC30-like GP5蛋白，以及绿脓杆菌外毒素转位结构域(PEA △DⅢ)和纯化标签8×His。[0026]本发明疫苗的制备具体包含以下内容，利用基因工程技术将猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinere productive and respiratory syndrome virus，PRRSV)流行毒株NADC30-like的GP5蛋白和绿脓杆菌外毒素蛋白(去除毒性结构域)的编码区串联到昆虫-杆状病毒系统表达载体上，经昆虫细胞High Five TM(购自Invitrogen)表达、重组蛋白纯化、乳化工艺后，可用做疫苗进行猪蓝耳病的预防。
[0027]本发明的有益效果至少在于：
[0028]1、本发明采用昆虫细胞表达系统，相比于现有技术中的原核表达系统，能够最大可能的保持蛋白质在真核生物体内的结构和修饰状态。
[0029]2、本发明采用经密码子优化后的ORF5全长基因，无羧基端KEDL信号肽，融合蛋白能够分泌到细胞外，更易分离纯化；
[0030]3、本发明采用ORF5全长基因PEA结构1和2融合表达形成的重组蛋白，经免疫试验猪后并未发现炎症反应，疫苗安全性良好；
[0031]4、本发明的亚单位疫苗中包含了能够刺激细胞免疫应答的绿脓杆菌外毒素PEA转位结构域，能够有效刺激机体产生抗原特异性T细胞免疫应答，提高本方案中亚单位疫苗的免疫原性；
[0032]5、本发明的亚单位疫苗的N端中还包含了8个连续的组氨酸，即8×His标签，利于该融合蛋白亚单位疫苗的纯化步骤；
[0033]6、本发明疫苗保护效果良好，能够诱导有效的体液免疫和细胞免疫，适合用于临床对蓝耳病的预防。
附图说明
[0034]图1为WB检测PEA△DⅢ-GP5的表达结果，其中，泳道1、2、3分别为重组杆状病毒rAc-PEA △DⅢ-GP5接种HiFi细胞后第3、5、8天，细胞培养液中的目的蛋白表达情况；[0035]图2为SDS-PAGE检测PEA △DⅢ-GP5纯化结果，其中，泳道1为不接毒的HiFi细胞培养液；泳道2为重组杆状病毒rAc-PEA △DⅢ-GP5接种HiFi细胞后第8天培养液；泳道3为重组杆状病毒rAc-PEA △DⅢ-GP5接种HiFi细胞后第8天培养液纯化后所得目的蛋白；[0036]图3为WB检测PEA △DⅢ-GP5纯化结果，其中，泳道1为纯化后的融合蛋白PEA△D Ⅲ-GP5经50倍稀释后的样品测试结果；
[0037]图4为第二次免疫后第14天试验猪血清IFN-γ水平检测结果图。
具体实施方式
[0038]下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。[0039]实施例1
[0040]一、目的蛋白表达载体的构建
[0041]1、获取目的蛋白序列：
[0042]从NCBI得到PRRSV NADC30-like毒株的基因序列(Accession：MH651743)，选择GP5蛋白的核
苷酸序列并对其进行优化；从NC BI得到绿脓杆菌的基因序列(G e n Ba nk：CP039293)，选择外毒素PEA的转位结构域(去除其DomainⅢ，以下简称PEA△DⅢ)序列；将PEA△DⅢ和优化后的GP5基因序列串联，并加8×His标签序列，N端和C端分别加上NdeI和XhoI酶切位点，生物合成重组蛋白(PEA△DⅢ-GP5)的基因序列(如SEQ ID No.1所示)。[0043]2、将合成的融合蛋白pUC-PEA△DⅢ-GP5序列用NdeI和XhoI酶切位点连入表达载体pFastBacdual：
[0044](1)酶切pUC-PEA △DⅢ-GP5和昆虫杆状病毒表达载体pFastBacdual(购自丰晖生
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议