用于子宫内膜异位症的方法

用于子宫内膜异位症的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年2月25日提交的美国临时专利申请号62/981,431的权益，该临时专利申请的全文内容以引用方式并入本文。
3.政府许可权声明
4.本发明是在美国国立卫生研究院授予的p30-es029067的政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。

背景技术：

5.子宫内膜异位症是一种常见但复杂的炎性疾病，主要影响育龄期的女性，据估计，美国有5,500,000名女性，全球有176,000,000名女性表现出子宫内膜异位症症状。当子宫内膜细胞植入远端部位时会形成子宫内膜异位症，这些远端部位可包括骨盆区域、腹膜表面、卵巢、韧带、肠道和膀胱。子宫内膜异位症部分地源于经血倒流；从而导致子宫内膜异位病变，这些子宫内膜异位病变的严重程度和疼痛以及总体短期或长期不良健康影响是可变的。一旦确诊，疾病的分期(即i-iv期)及其位置对于确定适当的方案很重要，方案可包括子宫内膜异位组织的手术切除和激素疗法，激素疗法包括孕酮、口服和gnrh拮抗剂。使用激素疗法来育龄妇女的子宫内膜异位症存在严重问题，需要开发毒性更小的激素非依赖性。
6.目前仍需要一种能避免或减少子宫内膜异位症常规激素疗法的明显副作用的方法。
7.在子宫内膜异位症中激活的信号传导通路类似于在癌症中观察到的信号传导通路，并包括与巨噬细胞募集和激活相关的炎症介导的应答、促生长和存活基因/通路的激活以及血管生成/促迁移基因/通路。例如，mtor信号传导在子宫内膜异位症中被激活。然而，使用mtor抑制剂来这种疾病因毒性问题而受到限制。
8.孤儿核受体：核受体亚科4组a成员1(nr4a1)(诸如根据seq id no.1)、核受体亚科4组a成员2(nr4a2)和核受体亚科4组a成员3(nr4a3)是由多种应激源诱导的即刻早期基因，并且nr4a受体在维持细胞稳态和疾病中起重要作用。越来越多的证据表明这些受体在代谢、心血管和神经功能以及在炎症和炎性疾病以及在免疫功能和癌症中的作用。nr4a1调节肺癌、黑素瘤、胰腺癌、结肠癌、宫颈癌、卵巢癌和胃癌以及横纹肌肉瘤细胞系中的癌细胞增殖、存活、细胞周期进展、迁移和侵袭，并且这些应答被在癌细胞中充当拮抗剂的双吲哚衍生的nr4a1配体抑制。
9.还有证据表明nr4a1在子宫内膜异位症中过度表达，据报道，在具有高nr4a1血清表达的患者中采取超声引导下的乙醇硬化后，该受体的水平在后显著降低。与正常子宫内膜相比，卵巢子宫内膜异位组织中的磷酸化nr4a1水平更高；此外，nr4a1的损失会刺激纤维化，并且nr4a1激动剂cytosporoneβ激活nr4a1表明该受体可防止纤维化。ishikawa子宫内膜癌细胞经常被用作子宫内膜异位上皮细胞的模型，我们最近的研究清楚地表明，nr4a1表现出被nr4a1拮抗剂抑制的促子宫内膜异位活性。

技术实现要素：

10.本公开提供了子宫内膜异位症的此类方法连同其他相关优点。就这一点而言，本公开证实，nr4a1调节被nr4a1拮抗剂抑制的多种促子宫内膜异位基因/通路，并且在一个方面，提供了通过调节核受体亚科4组a成员1(nr4a1)活性来个体的子宫内膜异位症的方法，该方法包括向个体施用有效量的本公开的化合物，诸如nr4a1配体。
11.在一个实施方案中，nr4a1配体具有下式：
[0012][0013]
或其盐，
[0014]
其中，
[0015]
r1、r2、r1'和r2'各自独立地选自氢、含有一至约十个碳原子的直链烷基基团和含有一至约十个碳原子的支链烷基基团；
[0016]
r3、r4、r5、r6、r3'、r4'、r5'和r6'各自独立地选自氢、卤素、含有一至约十个碳原子的直链烷基基团、含有一至约十个碳原子的支链烷基基团、含有一至约十个碳原子的烷氧基基团和硝基基团；
[0017]
r7选自氢、含有一至约十个碳原子的直链烷基基团、含有一至约十个碳原子的支链烷基基团、含有一至约十个碳原子的环烷基基团和芳基基团；
[0018]
r8、r9、r
10
、r
11
和r
12
独立地选自h、卤素、含有一至约十个碳原子的直链烷基基团、含有一至约十个碳原子的支链烷基基团、含有一至约十个碳原子的烷氧基基团、含有一至约十个碳原子的卤代烷基基团、硝基基团、羟基基团和含有一至约十个碳原子的卤代烷氧基基团；
[0019]
其中r8、r9、r
10
、r
11
和r
12
中的至少一者为oh，并且
[0020]
其中当r
10
为oh时，r8、r9、r
11
和r
12
中的至少一者不是氢。
[0021]
提供该概述是为了以简化的形式介绍一些概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。该概述不旨在标识所要求保护的主题的关键特征，也不旨在用于帮助确定所要求保护的主题的范围。
附图说明
[0022]
当结合附图时，因为通过参考以下详细描述可以更好地理解所要求保护的主题，所以所要求保护的主题的前述方面和许多伴随的优点将变得更容易理解，其中：
[0023]
图1a-图1d示出了根据本公开的一个实施方案，在子宫内膜异位细胞中nr4a1敲除的影响，其中esect-7和esect-40细胞用靶向nr4a1[sinr4a1(1)和sinr4a1(2)]的下调的寡核苷酸转染，并示出了对细胞增殖(图1a)、nr4a1表达(图1b)、促生长(图1c)和促凋亡(图1d)基因产物的影响；
dim(每天一次)，并且另一组中的小鼠用溶媒(每天一次)30天；
[0040]
图9b显示了根据本公开的一个实施方案，在药物后第4、7、16、23和30天测定的人异位病变的荧光素酶活性；并且
[0041]
图9c用图形示出了根据本公开的一个实施方案，基于图9b中所示的萤光素酶活性，与第0天药物相比萤光素酶活性的相对倍数。
具体实施方式
[0042]
子宫内膜异位症是一种炎性疾病，主要影响育龄期的女性，由于当前的激素疗法令人担忧，因此需要新的激素非依赖性方案。诸如根据seq id no.1的孤儿核受体4a1(nr4a1，nur77)在源自患者的(基质)子宫内膜异位细胞以及上皮细胞系中表达，并且本公开证实，在源自患者的esect-7和esect-40细胞中nr4a1的敲除降低细胞增殖并诱导细胞凋亡。此外，用双吲哚衍生的nr4a1配体1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(dim-c-pphoh)及其支持的3-氯-5-甲氧基类似物(dim-c-pphoh-3-cl-5-och3)处理这些细胞抑制细胞生长并诱导细胞凋亡和相关基因。本公开的化合物在功能和反式激活测定中均表现出nr4a1拮抗剂活性，而在正常(nem)子宫内膜细胞中未观察到这些作用。本公开还证实，nr4a1敲除和用nr4a1拮抗剂处理减少了esect-7和esect-40细胞中的纤维化、α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)和相关的促纤维化基因，并且在源自上皮细胞的子宫内膜异位细胞系中观察到类似的结果。此外，在具有自体移植的子宫内膜异位症小鼠模型中，以及同样在移植有人子宫内膜异位细胞的scid小鼠中，用25mg/kg/天dim-c-pphoh-3-cl-5-och3显著抑制子宫内膜异位病变的生长和扩增。因此，本公开证实，双吲哚衍生的nr4a1配体是一类用于子宫内膜异位症的非激素疗法的新型药物。
[0043]
因此，在一个方面，本公开提供了子宫内膜异位症的方法。在一个实施方案中，这些方法包括可通过调节nr4a1活性而的个体的子宫内膜异位症，这包括向个体施用有效量的化合物，诸如nr4a1配体。在一个实施方案中，该化合物是亚甲基取代的二吲哚甲烷。在某些实施方案中，根据本公开的化合物被不同地称为“cdim”或“c-dim”化合物。如本文进一步讨论的，在某些实施方案中，此类化合物是亚甲基取代的二吲哚甲烷化合物，诸如根据本公开的实施方案的化学式。
[0044]
在一些实施方案中，调节nr4a1活性包括将本文别处描述的化合物与nr4a1蛋白结合。在一些实施方案中，该化合物具有拮抗活性，即该化合物在刺激受体(例如，拮抗剂配体)的关联功能方面具有降低的功效或没有功效。在一些实施方案中，拮抗剂配体阻断受体的组成型功能及其刺激性关联配体结合nr4a1蛋白并激活nr4a1依赖性基因的能力。在一些实施方案中，nr4a1配体可为组织特异性、应答特异性或基因特异性激动剂。在一个实施方案中，nr4a1配体在个体的子宫内膜异位细胞中有效。此类子宫内膜异位细胞与个体的正常子宫内膜异位(new)细胞形成对比。
[0045]
术语“拮抗剂”是指可与nr4a1受体组合以降低或抑制分子和细胞活性的化合物。拮抗剂可为直接结合受体的配体。另选地，拮抗剂可通过例如以下方式与受体间接组合：(a)与直接结合受体的另一种分子或蛋白质形成复合物，或(b)以其他方式导致另一种化合物的修饰，使得另一种化合物直接结合nr4a1受体。
[0046]
术语“激动剂”是指可与nr4a1受体组合以产生或增加分子和细胞活性的化合物。
激动剂可为直接结合受体的配体。另选地，激动剂可通过例如以下方式与受体间接组合：(a)与直接结合受体的另一种分子或蛋白质形成复合物，或(b)以其他方式导致另一种化合物的修饰，使得另一种化合物直接结合nr4a1受体。
[0047]
术语“激活”及其变型是指分子和细胞活性的任何可测量的增加。
[0048]
在一个实施方案中，细胞在体外与化合物或药物组合物接触。在一个实施方案中，通过向受试者施用有效量的化合物或药物组合物使细胞在体内与化合物或药物组合物接触。
[0049]
在一个实施方案中，nr4a1的调节诱导选自efgr、cmyc、生存素、bcl-2、sma以及它们的组合的蛋白质的下调。如例如实施例2和实施例3以及图1c、图1d、图2d和图3c所示，本公开的化合物在施用于受试者时适合诸如在子宫内膜异位细胞中并相对于对照，诱导efgr、cmyc、生存素、bcl-2的下调。在一个实施方案中，efgr是根据seq id no.2。在一个实施方案中，cmyc是根据seq id no.3。在一个实施方案中，生存素是根据seq id no.4。在一个实施方案中，bcl-2是根据seq id no.5。如例如实施例4和图6b所示，本公开的化合物适合诸如在子宫内膜细胞中并相对于对照，诱导sma的下调。在一个实施方案中，sma是根据seq id no.6。
[0050]
在一个实施方案中，nr4a1活性的调节诱导包括bax在内的蛋白质的上调。如例如实施例2和实施例3以及图1c、图1d、图2d和图3c所示，本公开的化合物在施用于受试者时适合诸如在子宫内膜异位细胞中并相对于对照，诱导bax的下调。在一个实施方案中，bax是根据seq id no.7。
[0051]
在一个实施方案中，nr4a1活性的调节诱导选自fn、col1a1、ctgf以及它们的组合的纤维化标记物的mrna水平降低。如例如实施例4和图6b所示，化合物在施用于受试者时适合诸如在子宫内膜细胞中并相对于对照，诱导纤维化标记物诸如fn、col1a1、ctgf的mrna水平降低。在一个实施方案中，fn是根据seq id no.8。在一个实施方案中，col1a1是根据seq id no.9。在一个实施方案中，ctgf是根据seq id no.10。
[0052]
在一个实施方案中，nr4a1活性的调节切割parp和半胱天冬酶-3。如图所示，根据本公开的化合物在施用于受试者时适合诸如在子宫内膜细胞中并相对于对照，诱导parp和半胱天冬酶-3的切割。在一个实施方案中，parp是根据seq id no.11。在一个实施方案中，半胱天冬酶-3是根据seq id no.12。
[0053]
虽然描述了蛋白质的特定实施方案，但应理解，这些蛋白质的其他同源物或同种型也在本公开的范围内。
[0054]
在一个实施方案中，nr4a1活性的调节在卵巢子宫内膜瘤中诱导细胞凋亡。
[0055]
在一个实施方案中，相对于对照，nr4a1活性的调节不抑制正常子宫内膜细胞的生长。
[0056]
在一个实施方案中，诸如相对于对照，nr4a1活性的调节抑制纤维化的进展。
[0057]
在一个实施方案中，相对于对照，nr4a1活性的调节抑制nr4a1在子宫内膜异位细胞中的内在转录活性。在一个实施方案中，相对于对照，nr4a1活性的调节抑制异位病变的生长。
[0058]
在一个实施方案中，本公开的nr41配体是根据下式：
[0059][0060]
或其盐，
[0061]
其中，
[0062]
r1、r2、r1'和r2'各自独立地选自氢、含有一至约十个碳原子的直链烷基基团和含有一至约十个碳原子的支链烷基基团；
[0063]
r3、r4、r5、r6、r3'、r4'、r5'和r6'各自独立地选自氢、卤素、含有一至约十个碳原子的直链烷基基团、含有一至约十个碳原子的支链烷基基团、含有一至约十个碳原子的烷氧基基团和硝基基团；
[0064]
r7选自氢、含有一至约十个碳原子的直链烷基基团、含有一至约十个碳原子的支链烷基基团、含有一至约十个碳原子的环烷基基团和芳基基团；
[0065]
r8、r9、r
10
、r
11
和r
12
独立地选自h、卤素、含有一至约十个碳原子的直链烷基基团、含有一至约十个碳原子的支链烷基基团、含有一至约十个碳原子的烷氧基基团、含有一至约十个碳原子的卤代烷基基团、硝基基团、羟基基团和含有一至约十个碳原子的卤代烷氧基基团；
[0066]
其中r8、r9、r
10
、r
11
和r
12
中的至少一者为oh，并且
[0067]
其中当r
10
为oh时，r8、r9、r
11
和r
12
中的至少一者不是氢。
[0068]
如本领域技术人员所理解的，被称为单价化学部分(例如，烷基、芳基等)的化学部分还包括结构上允许的多价部分。例如，虽然“烷基”部分通常是指一价基团(例如，ch3ch
2-)，但在适当的情况下，“烷基”部分也可以指二价基团(例如，-ch2ch
2-，其等同于“亚烷基”基团)。类似地，在需要二价部分的情况下，本领域的技术人员将理解术语“芳基”是指对应的二价亚芳基基团。
[0069]
本文使用的术语可在单破折号
“‑”
或双破折号“＝”之前和/或之后，以指示指定的取代基与其母体部分之间的键的键序；单破折号指示单键，并且双破折号指示双键。在不存在单破折号或双破折号的情况下，应理解，在取代基与其母体部分之间形成单键；此外，除非破折号另有说明，否则应旨在“从左到右”阅读取代基。例如，c
1-c6烷氧基羰基氧基和-oc(o)c
1-c6烷基指示相同的官能度；类似地，芳基烷基和-烷基芳基指示相同的官能度。
[0070]
所有原子都被理解为具有它们形成键的正常化合价数(例如，碳为4，n为3，o为2，并且s根据原子的氧化态为2、4或6)。有时，可将部分定义为例如(a)ab，其中a为0或1。在此类情况下，当a为0时，部分为b，并且当a为1时，部分为ab。
[0071]
当取代基中相同类型的原子或基团的数量可以变化时(例如，烷基基团可为c1、c2、c3等)，重复原子或基团的数量可由范围(例如，c
1-c6烷基)表示，该范围包括范围内的每一个数字以及任何和所有子范围。例如，c
1-c3烷基包括c1、c2、c3、c
1-2
、c
1-3
和c
2-3
烷基。
[0072]
除非另外指明，否则本文所用的术语“烷基”意指含有1至10个碳原子的直链或支
链烃。烷基的代表性示例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正-己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。当“烷基”基团是两个其他部分之间的连接基团时，它也可为直链或支链；示例包括但不限于-ch
2-、-ch2ch
2-、-ch2ch2chc(ch3)-、-ch2ch(ch2ch3)ch
2-。
[0073]
本文所用的术语“环烷基”意指单环或双环的环烷基环系。单环环系是含有3至8个碳原子的环状烃基团，其中此类基团可以是饱和或不饱和的，但不是芳族的。在某些实施方案中，环烷基基团是完全饱和的。单环环烷基的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。双环环烷基环系是桥连的单环或稠合的双环。桥连的单环含有单环的环烷基环，其中单环的两个不相邻的碳原子通过具有介于一至三个之间的附加碳原子的亚烷基桥连接(即，形式为-(ch2)
w-的桥连基团，其中w是1、2或3)。
[0074]“烷氧基”是指通过氧原子附接至母体分子部分的如本文所定义的烷基基团。烷氧基的代表性示例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基和己氧基。
[0075]
本文所用的术语“芳基”意指苯基(即单环芳基)或含有至少一个苯环的双环环系或在芳族双环环系中仅含有碳原子的芳族双环。双环芳基可为薁基、萘基，或为与单环环烷基、单环环烯基或单环杂环基稠合的苯基。双环芳基通过包含在双环系的苯基部分内的任何碳原子，或萘环或薁环内的任何碳原子连接至母体分子部分。双环芳基的稠合单环环烷基或单环杂环基部分任选地被一个或两个氧基和/或该基团取代。
[0076]“卤素”是指氯、溴、氟或碘原子基团。术语“卤素”也设想了术语“卤代”或“卤化物”。
[0077]
术语“卤代烷基”、“卤代烯基”和“卤代烷氧基”是指烷基、烯基或烷氧基基团，视情况而定，其被一个或多个卤素原子取代。
[0078]
本文所用的术语“硝基”意指-no2基团。
[0079]
本文所用的术语“取代的”意指指定部分的氢基团被指定取代基的基团取代，条件是取代产生稳定的或化学上可行的化合物。术语“可取代的”当参考指定原子使用时意指，连接至原子的是氢基团，它可被合适的取代基的基团取代。
[0080]
在另一个实施方案中，本公开涉及通过调节nr4a1来个体的子宫内膜异位症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用如wo2021/022220中所述的双吲哚衍生的化合物。wo2021/022220的公开内容据此以引用方式并入本文以用于其公开。在一些实施方案中，该方法还包括通过双吲哚衍生的化合物与核受体4a1(nr4a1)和核受体4a2(nr4a2)中的至少一者结合。在一些实施方案中，双吲哚衍生的化合物(cdim)在其苯环上包括两个或更多个取代基。在一些实施方案中，双吲哚衍生的化合物包括但不限于1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对氯苯基)甲烷(dim-c-pphcl；4-cl)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)甲烷(3-cf
3-4-cl)、1,l-二甲基-1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(n-me-4-oh)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-溴-2-羟基-苯基)甲烷(2-oh-4-br)、1-双(3'-吲哚基)-1-(对溴苯基)甲烷(dim-c-pphbr)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(cdim8)、cdim8的3,5-二取代的类似物、cdim8-3,5-(ch3)2、cdim8-3,5-br2、cdim8-3,5-cl2、cdim8-3-br-5-och3、cdim8-3-cl-5-och3、cdim8-3-cl-5-br、cdim8-3-cl-5-f、cdim、cdim的3,5-二取代
的类似物、cdim-3,5-br2、cdim-2,5-br2、cdim-3,5-cl2、cdim-3,5-(ch3)2、cdim-3-br-5-ocf3、cdim-3-br-5-och3、cdim-3-br-5-cf3、cdim-3-cl-5-och3、cdim-3-cl-5-ocf3、cdim-3-cl-5-cf3以及它们的组合。在一个实施方案中，双吲哚衍生的化合物是cdim-3-br-5-cf3。
[0081]
2-羟基配体
[0082]
在一些实施方案中，r8为oh。在某些情况下，因为oh基团位于中心苯基基团上，所以此类配体在本文中被称为“2-羟基”和/或“2-oh”配体。在某些此类实施方案中，r9、r
10
、r
11
和r
12
各自为h。在某些其他实施方案中，r9、r
10
、r
11
和r
12
独立地选自卤素、ch3、occl3、cf3、叔丁基、och3、oh、c6h5和cn。在一个实施方案中，r
10
为och3。在一个实施方案中，r
11
选自ch3、och3和cf3。在一个实施方案中，r9和r
11
为br。
[0083]
在一个实施方案中，本公开的组合物具有以下结构中的一种结构：
[0084]
[0085][0086]
及其盐。
[0087]
3-羟基配体
[0088]
在一些实施方案中，r9为oh。在某些情况下，因为oh基团位于中心苯基基团上，所以此类配体在本文中被称为“3-羟基”和/或“3-oh”配体。在某些此类实施方案中，r8、r
10
、r
11
和r
12
各自为h。在某些其他实施方案中，r8、r
10
、r
11
和r
12
独立地选自卤素、ch3、occl3、cf3、叔丁基、och3、oh、c6h5和cn。在某些实施方案中，r8为卤素。
[0089]
在一个实施方案中，本公开的组合物具有以下结构中的一种结构：
[0090]
[0091][0092]
及其盐。
[0093]
4-羟基配体
[0094]
在一些实施方案中，r
10
为oh。在某些情况下，因为oh基团位于中心苯基基团上，所以此类配体在本文中被称为“4-羟基”和/或“4-oh”配体。在某些此类实施方案中，r8、r9、r
11
和r
12
独立地选自卤素、ch3、occl3、cf3、叔丁基、och3、oh、c6h5和cn。在某些其他实施方案中，r9为卤素并且r
11
选自h、卤素和och3。
[0095]
在一个实施方案中，本公开的组合物具有以下结构中的一种结构：
[0096][0097]
及其盐。
[0098]
本公开的c-dim化合物可通过取代的苯甲醛与吲哚或取代的吲哚的缩合来制备。
这些化合物可通过将两份吲哚或取代的吲哚与一份苯甲醛或取代的苯甲醛在稀乙酸中在80℃-90℃下温育24小时-48小时来合成。通过过滤回收固体并使其从苯或苯/己烷中结晶，得到70％-90％产率的c-dim。使用单一吲哚起始材料会产生对称的产物，而使用两种不同的吲哚起始材料会导致不对称的产物。
[0099]
代表性c-dim化合物的制备和表征描述于例如美国专利7,232,843中，其全文以引用方式并入本文。
[0100]
考虑到递送途径、化合物的代谢和其他药代动力学参数，诸如分布体积、清除率、受试者的年龄等等，本领域普通技术人员将能够确定用于施用组合物的最有效剂量和时间。例如，nr4a1配体诸如nr4a1拮抗剂可以任何熟知的方法施用，诸如通过局部施用、口服施用、静脉内注射、腹膜内注射、肌内注射、鼻内施用、透皮施用、直肠施用，或通过将有效量的活性剂递送至待的组织或部位的任何方式来施用。合适的剂量是达到期望终点的剂量。应当理解，不同的障碍可能需要不同的剂量。药剂的有效量为例如导致赘生性细胞计数、生长、尺寸、细胞迁移或细胞侵袭停止或显著降低的量。
[0101]
组合物可与药物载体和/或稀释剂一起施用。药剂也可与其他药剂组合施用，例如与适用于子宫内膜异位症的其他化合物联合施用。可用于本发明的药物载体或稀释剂的示例包括任何生理缓冲介质，即ph约为7.0至7.4并包含合适的水溶性有机载体的生理缓冲介质。合适的水溶性有机载体包括但不限于玉米油、二甲亚砜、明胶胶囊等等。
[0102]
本文使用的术语“有效量”是指化合物或组合物的量足以特定障碍、病症或疾病诸如改善、缓解、减轻和/或延迟其症状中的一种或多种症状。参考子宫内膜异位症或其他多余的细胞增殖，有效量包括足以导致子宫内膜异位病变缩小和/或降低子宫内膜异位病变的生长速率的量。在一些实施方案中，有效量是足以延迟发展的量。在一些实施方案中，有效量是足以防止发生和/或复发的量。有效量可以一次或多次施用来施用。
[0103]
用于用途的“药学上可接受的载体”在药学领域是众所周知的，并且描述于例如《remington's pharmaceutical sciences》，第18版(easton,pa.：mack publishing company，1990年)。例如，可使用生理ph下的无菌盐水和磷酸盐缓冲盐水。可在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至矫味剂。例如，可添加苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯，作为防腐剂。如前述文献中第1449页所述。此外，可使用抗氧化剂和混悬剂。如前述文献所述。
[0104]
适用于非液体制剂的赋形剂也是本领域技术人员已知的。对药学上可接受的赋形剂和盐的详细讨论可见于《remington's pharmaceutical sciences》，第18版(easton,pa.：mack publishing company，1990年)。
[0105]
此外，辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、生物缓冲物质、表面活性剂等可存在于此类溶媒中。生物缓冲剂可为药理学上可接受的并为制剂提供期望的ph的任何溶液，即生理学上可接受的范围内的ph。缓冲溶液的示例包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、tris缓冲盐水、hank缓冲盐水等。
[0106]
取决于预期的施用模式，药物组合物可为固体、半固体或液体剂型的形式，诸如例如片剂、栓剂、丸剂、胶囊剂、散剂、液体剂、混悬剂、乳膏剂、软膏剂、洗剂等，优选为适用于单次施用精确剂量的单位剂型。这些组合物将包含有效量的选定药物与药学上可接受的载体的组合，此外，还可包含其他药剂、佐剂、稀释剂、缓冲剂等。
[0107]
本公开包括药物组合物，该药物组合物包含本公开的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及一种或多种药学上可接受的载体和任选的其他性和/或预防性成分，该化合物包括异构体、异构体的外消旋或非外消旋混合物。
[0108]
通常，本公开的化合物将通过可接受的施用模式中的任何可接受的施用模式以有效量施用。合适的剂量范围取决于多种因素，诸如待的疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所用化合物的效力、施用途径和形式、施用所针对的适应症以及相关执业医师的偏好和经验。此类疾病的领域的普通技术人员将能够在不进行不当实验的情况下依赖个人知识和本技术的公开内容来确定本公开的化合物针对给定疾病的有效量。
[0109]
因此，本公开的化合物可作为药物制剂，包括适用于口服(包括口腔和舌下)、直肠、鼻、局部、肺、阴道或肠胃外(包括肌内、动脉内、鞘内、皮下和静脉内)施用的药物制剂施用，或以适用于通过吸入或吹入施用的形式施用。优选的施用方式是使用便利的每日剂量方案的静脉内或口服施用，每日剂量方案可根据痛苦程度进行调整。
[0110]
对于固体组合物，常规的无毒固体载体包括例如药用级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。液体药学上可施用的组合物可例如通过将本文所述的活性化合物和任选的药物佐剂溶解、分散在赋形剂诸如例如水、盐水、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇等中等方式来制备，从而形成溶液或悬浮液。如果需要，待施用的药物组合物还可含有少量的无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂等，例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯等。制备此类剂型的实际方法对于本领域技术人员而言是已知的或将是显而易见的，例如参见上文引用的《remington's pharmaceutical sciences》。
[0111]
又一个实施方案是渗透促进剂赋形剂的用途，这些渗透促进剂赋形剂包括聚合物，诸如：聚阳离子(壳聚糖及其季铵衍生物、聚-l-精氨酸、胺化明胶)；聚阴离子(n-羧甲基壳聚糖、聚丙烯酸)；和硫醇化聚合物(羧甲基纤维素-半胱氨酸、聚卡波非-半胱氨酸、壳聚糖-硫代丁基脒、壳聚糖-巯基乙酸、壳聚糖-谷胱甘肽缀合物)。
[0112]
对于口服施用，该组合物通常采取片剂、胶囊剂、软胶囊的形式，或者可以是水性或非水性溶液、悬浮液或糖浆。片剂和胶囊剂是优选的口服施用形式。用于口服使用的片剂和胶囊剂可包括一种或多种常用的载体，诸如乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，诸如硬脂酸镁。通常，本公开的化合物可与口服、无毒、药学上可接受的惰性载体诸如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇、山梨糖醇等组合。此外，当需要或必要时，也可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着剂掺入混合物中。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖诸如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶诸如阿拉伯树胶、黄芪胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。
[0113]
因此，例如，可通过常规程序制备胶囊，使得剂量单位为100mg本公开的化合物、100mg纤维素和10mg硬脂酸镁。还可通过装填各自具有100mg粉状活性成分、150mg乳糖、50mg纤维素和10mg硬脂酸镁的标准两片式硬明胶胶囊来制备大量的单位胶囊。或者，可通过常规程序制备片剂，使得剂量单位为100mg本公开的化合物、150mg乳糖、50mg纤维素和
10mg硬脂酸镁。还可通过常规程序制备大量片剂，使得剂量单位为100mg本公开的化合物，其他成分可为0.2mg胶态二氧化硅、5mg硬脂酸镁、250mg微晶纤维素、10mg淀粉和100mg乳糖。可施涂适当的包衣来增加适口性或延迟吸收。
[0114]
当使用液体混悬剂时，活性剂可与任何口服、无毒、药学上可接受的惰性载体诸如乙醇、甘油、水等以及与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，也可添加矫味剂、着剂和/或甜味剂。用于掺入本文的口服制剂中的其他任选组分包括但不限于防腐剂、悬浮剂、增稠剂等。
[0115]
肠胃外制剂可以常规形式，或者作为液体溶液或混悬剂、在注射前可下沉以溶解或悬浮在液体中的固体形式，或者作为乳剂制备。优选地，根据本领域已知的技术，使用合适的载体、分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制无菌可注射混悬剂。无菌可注射制剂也可为无菌可注射溶液或在肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂中的混悬剂。可以使用的可接受的溶媒和溶剂为水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油、脂肪酯或多元醇通常用作溶剂或悬浮介质。此外，肠胃外施用可涉及使用缓释或缓效系统以便保持恒定的剂量水平。
[0116]
肠胃外施用包括关节内、静脉内、肌内、皮内、腹膜内和皮下途径，并且包括水性和非水性等渗无菌注射溶液以及水性和非水性无菌混悬剂，这些水性和非水性等渗无菌注射溶液可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，这些水性和非水性无菌混悬剂可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。经由某些肠胃外途径施用可涉及通过由无菌注射器或一些其他机械装置诸如连续输注系统推动的针头或导管将本公开的制剂引入患者体内。由本公开提供的制剂可通过针头、注射器、泵或本领域公认的用于肠胃外施用的任何其他装置来施用。
[0117]
优选地，根据本领域已知的技术，使用合适的载体、分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制无菌可注射混悬剂。无菌可注射制剂也可为无菌可注射溶液或在肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂中的混悬剂。可以使用的可接受的溶媒和溶剂为水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油、脂肪酯或多元醇通常用作溶剂或悬浮介质。此外，肠胃外施用可涉及使用缓释或缓效系统以便保持恒定的剂量水平。
[0118]
用于肠胃外施用的根据本公开的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、混悬剂或乳剂。非水性溶剂或溶媒的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油和玉米油)、明胶和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。此类剂型还可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。它们可通过例如过滤通过细菌保留过滤器、通过将灭菌剂掺入组合物中、通过辐照组合物或通过加热组合物来进行灭菌。它们也可在临使用前使用无菌水或一些其他无菌可注射介质制造。
[0119]
制剂可任选地含有等渗剂。制剂优选地含有等渗剂并且甘油是最优选的等渗剂。当使用甘油时，其浓度在本领域已知的范围内，诸如例如约1mg/ml至约20mg/ml。
[0120]
肠胃外制剂的ph可通过缓冲剂诸如磷酸盐、乙酸盐、tris或l-精氨酸来控制。缓冲剂的浓度优选地足以在存储期间提供ph缓冲以将ph保持在目标ph
±
0.2ph单位。当在室温下测量时，优选的ph处于约7和约8之间。
[0121]
可任选地将其他添加剂诸如药学上可接受的增溶剂，如tween(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、tween(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、tween
(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)、pluronic(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和peg(聚乙二醇)添加到制剂，并且如果制剂将接触塑料材料，则可使用这些添加剂。此外，肠胃外制剂可含有各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。
[0122]
通过将所需量的本公开的化合物中的一种或多种化合物与上面列举的各种其他成分(根据需要)掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，分散体是通过将各种已灭菌的活性成分掺入无菌溶媒中来制备的，该无菌溶媒含有基本分散介质和来自上文列举的那些的所需其他成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌散剂而言，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术由活性成分加上任何附加期望成分的先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何附加期望成分的散剂。因此，例如，通过在10体积％丙二醇和水中搅拌1.5重量％活性成分来制备适用于通过注射施用的肠胃外组合物。用氯化钠使溶液等渗并灭菌。
[0123]
另选地，本公开的药物组合物可以用于直肠施用的栓剂的形式施用。这些栓剂可通过将药剂与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中熔化以释放药物。此类材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
[0124]
本公开的药物组合物也可通过鼻用气溶胶或吸入施用。此类组合物根据药物制剂领域熟知的技术，采用苯甲醇或其他合适的防腐剂、吸收促进剂以提高生物利用度、推进剂诸如氟化烃或氮气以及/或者其他常规增溶剂或分散剂来制备并且可被制备为盐水溶液。
[0125]
用于局部药物递送的优选制剂是软膏剂和乳膏。软膏剂是半固体制剂，这些制剂通常基于凡士林或其他石油衍生物。如本领域已知的，含有选定活性剂的乳膏是粘稠液体或半固体乳剂，这些半固体乳剂是水包油型或油包水型的。乳膏基质是可水洗的，并含有油相、乳化剂和水相。油相有时也被称为“内”相，通常由凡士林和脂肪醇诸如鲸蜡醇或硬脂醇组成；尽管不一定，但水相通常在体积上超过油相，并且通常含有湿润剂。乳膏制剂中的乳化剂通常是非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂。如本领域技术人员将理解的，待使用的特定软膏剂或乳膏基质是将提供最佳药物递送的基质。与其他载体或溶媒一样，软膏基质应该是惰性的、稳定的、无刺激性的和无致敏的。
[0126]
用于口腔施用的制剂包括片剂、锭剂、凝胶剂等。另选地，可使用本领域技术人员已知的透粘膜递送系统进行口腔施用。本公开的化合物也可使用常规的透皮药物递送系统，即其中药剂通常包含在用作药物递送装置的层合结构内以附贴到身体表面的透皮“贴剂”，通过皮肤或粘膜组织递送。在这种结构中，药物组合物通常包含在上背衬层下面的层或“药盒”中。层合装置可包括单个药盒，或者它可包括多个药盒。在一个实施方案中，药盒包括用于在药物递送期间将系统附贴到皮肤的药学上可接受的接触粘合剂材料的聚合物基质。合适的皮肤接触粘合剂材料的示例包括但不限于聚乙烯、聚硅氧烷、聚异丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯等。另选地，盛有药物的药盒和皮肤接触粘合剂作为单独且不同的层存在，并且在药盒下面的粘合剂在这种情况下可为如上所述的聚合物基质，或者可为液体或凝胶剂药盒，或者可采取某些其他形式。这些层合物中的背衬层用作装置的上表面，充当层合结构的主要结构元件，并为装置提供很大的灵活性。选择用于背衬层的材料应当对活性剂和存在的任何其他材料是基本上不可渗透的。
[0127]
本公开的化合物可被配制用于气溶胶施用，特别是呼吸道施用并包括鼻内施用。
该化合物通常将具有例如大约5微米或更小的小粒度。这样的粒度可通过本领域已知的方式，例如通过微粉化获得。活性成分与合适的推进剂诸如氯氟烃(cfc，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷)、二氧化碳或其他合适的气体一起提供在加压包装中。气溶胶还可方便地含有表面活性剂，诸如卵磷脂。剂量可由计量阀控制。另选地，活性成分可以干燥散剂的形式提供，例如以化合物在合适的散剂基质诸如乳糖、淀粉、淀粉衍生物诸如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)中的散剂混合物提供。散剂载体将在鼻腔中形成凝胶。散剂组合物可以单位剂型存在于例如明胶或泡罩包装的例如胶囊或盒中，散剂可通过吸入器从这些胶囊或盒中施用。
[0128]
将药学或有效量的组合物递送至受试者。精确的有效量将随受试者而异，并且将取决于物种、年龄、受试者的体型和健康状况、所病症的性质和严重性、医师的建议以及选择用于施用的剂或剂组合。因此，可通过常规实验确定给定情况下的有效量。为了本公开的目的，在至少一个剂量中，量通常将在约0.01mg/kg至约250mg/kg，更优选地约0.1mg/kg至约10mg/kg体重的范围内。在较大的哺乳动物中，所示的每日剂量可以是约1mg至300mg，每天一次或多次，更优选地在约10mg至200mg的范围内。根据减少和/或减轻所讨论的障碍的体征、症状或原因，或引起生物系统的任何其他期望改变的需要，可向受试者施用多次剂量。当需要时，可制备具有适用于活性成分的缓释或控释施用的肠溶衣的制剂。
[0129]
药物制剂优选地为单位剂型。在这种形式中，制剂被细分为含有适量活性组分的单位剂量。单位剂型可为包装制剂，该包装含有离散量的制剂，诸如小瓶或安瓿中的袋装片剂、胶囊剂和散剂。此外，单位剂型本身可为胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭剂，或者它可为这些包装形式中的适当数量的任何包装形式。
[0130]
个体可为任何动物，诸如哺乳动物、鸟、爬行动物或鱼。示例性哺乳动物类别包括啮齿动物、灵长类动物、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物、兔类动物等。例如，个体可为人、猴、猿或其他灵长类动物、小鼠、大鼠或其他啮齿动物、狗、猫、猪、马、牛或兔等。
[0131]
如本文所用，术语“”意指提供对障碍或病症的改善、治愈或预防效果。在一些实施方案中，包括防止病症的升级或进展，或减慢病症的升级或进展的速率(与未或其他相比)。在子宫内膜异位症的情况下(下文详述)，包括减缓或防止细胞生长或细胞分裂速率、减缓或防止细胞迁移以及/或者减缓或防止细胞侵袭。在一个实施方案中，子宫内膜异位症的包括减小异位病变的体积和/或抑制异位病变的生长速率。
[0132]
如本公开的实施例和附图所示，根据本公开的一个实施方案，本公开的c-dim/nr4a1拮抗剂通过激活细胞凋亡而抑制从卵巢子宫内膜瘤分离的esect-7和esect-40细胞的生长，但不抑制nem(正常)子宫内膜细胞的生长，即使nr4a1在nem细胞中表达。与子宫内膜异位细胞相比，dim-c-pphoh和dim-c-pphoh-3-cl-5-och3作为nr4a1激动剂诱导c2c12肌细胞中参与葡萄糖摄取过程的基因。对于表现出组织/细胞特异性活性的选择性受体调节剂，通常观察到cdim/nr4a1配体活性的这些细胞差异(例如：拮抗剂/激动剂/无活性)，这表明cdim是选择性nr4a1调节剂。这些化合物在子宫内膜异位细胞但非正常子宫内膜细胞中的有效性方面的选择性可能由于若干原因，这些原因包括必需辅因子的差异表达，目前正在研究这些原因。
[0133]
纤维化的发展可导致生殖力减弱和子宫内膜异位症期间的疼痛。zeng和同事发
ggc tgt ggg gt-3'(反义，seq id no.21)。
[0145]
萤光素酶测定：将esect-7和esect-40细胞接种在12孔板上的补充有2.5％木炭处理fbs的dmem/f12中。过夜附着和生长之后，根据制造商的方案，使用lipofectamine 2000试剂(invitrogen(carlsbad,ca))将不同量的dna[即uasx5-luc(500ng)、gal4-nr4a1(50ng)、nbrex3-luc(800ng)、nurrex3-luc(800ng)和flag-nr4a1(80ng)]共转染到每个孔中。转染6小时后，用含有溶剂(dmso)或指定浓度的化合物的接种培养基(如上)将细胞处理18小时。然后将细胞裂解并将细胞提取物用于荧光素酶活性的化学发光定量。对照通过bradford测定法确定的相应蛋白质浓度值将萤光素酶活性值标准化。gal4-nr4a1和flag-nr4a1两种构建体都含有全长nr4a1编码序列，并且先前描述了本研究中使用的所有质粒。
[0146]
具有自体移植的子宫内膜异位症小鼠模型：在麻醉下从雌性小鼠(6周龄，c57bl/6j)中分离出一个子宫角，然后纵向切开子宫角。使用2毫米皮肤活检穿孔器，从所分离的子宫中获得一个子宫内膜碎片，并随后将其缝合到附着在同一只小鼠的肠道上的肠系膜。然后通过缝合来闭合腹部切口。在收获异位病变之前，使用阴道细胞学测定小鼠动情周期。在子宫内膜异位症诱导后第3周的发情期，从患有子宫内膜异位症的小鼠中分离出异位病变。作为子宫内膜异位症对照，在10周龄的发情期从不患有子宫内膜异位症的c57bl/6j雌性小鼠中分离出子宫。
[0147]
用永生化人子宫内膜细胞异种移植的子宫内膜异位症小鼠模型：荧光素酶稳定的永生化人子宫内膜上皮细胞(lihesc)和荧光素酶稳定的永生化人子宫内膜基质细胞(lihesc)是由ihesc和iheec产生的，然后用荧光素酶活性测定法验证荧光素酶的表达，ihesc是从针对良性病症的子宫切除术获得的子宫内膜分离出的，并且iheec是通过转导表达慢病毒的荧光素酶由子宫内膜瘤产生的。将含有lihesc(1
×
106个细胞)和liheec(1
×
106个细胞)的混合物的基质胶注射到严重联合免疫缺陷(scid)雌性小鼠(6周龄)的腹膜腔中以诱导子宫内膜异位症。此后，我们将liheec和lihesc的混合物称为人子宫内膜细胞(hec)。异位病变在约80％的移植hec的scid小鼠中很好地发展，并且用针对波形蛋白和细胞角蛋白18的抗体的免疫染表明，异位病变是从hec成功发展的。为了无创地确定人异位病变的进展，我们在成像前5分钟向小鼠腹膜内注射150mg/kg的d-荧光素，然后使用in vivo image system活体成像系统测定小鼠中人异位病变的荧光素酶活性。
[0148]
用c-dim子宫内膜异位症：用如上所述的自体移植和异种移植方法将子宫内膜异位症诱导到小鼠。在小鼠中确立异位病变后(子宫内膜异位症诱导后第3周)，我们将患有子宫内膜异位症的小鼠随机分为两组，然后将实验组中的小鼠腹膜内注射25mg/kg的c-dim，持续三周(每日一次，每日)，并将对照组中的小鼠注射溶媒(5％ dmso和10％2-羟丙基-β-环糊精，每日一次)，持续三周。在自体移植模型的情况下，我们在药物后第3周的发情期从患有子宫内膜异位症的小鼠中分离出用c-dim对比溶媒的小鼠异位病变，然后确定它们的体积。在异种移植模型的情况下，我们确定了在药物期间在患有子宫内膜异位症的scid小鼠中用c-dim对比溶媒的人异位病变的荧光素酶活性。
[0149]
免疫组织化学：如先前所述，用10％中性缓冲的、福尔马林固定的且石蜡包埋的小鼠组织切片进行免疫染。对于免疫染，将切片脱蜡、再水化并在10mm柠檬酸盐缓冲液(ph为6.0)中煮沸10分钟。为了减少抗体的非特异性结合，将切片在含有0.1％ tween-20的磷酸盐缓冲盐水(pbst)中再次洗涤，并在室温下用10％山羊血清的pbst溶液预温育1小时。
我们用针对nr4a1的抗体(nb100-5674，novus，1:300)测定了子宫、在位子宫内膜和异位病变中的nr4a1水平。用dab(3,3'-二氨基联苯胺)底物试剂盒观察特定抗原。使用imagej程序定量免疫染强度。
[0150]
统计分析：所有实验最少重复三次。将数据表示为平均值
±
标准误差(se)。使用单因素方差分析确定统计显著性。认为p值《0.05具有统计学显著性。
[0151]
实施例2：nr4a1的表达和受体敲除的影响
[0152]
最近的研究表明，nr4a1在子宫内膜癌细胞(ishikawa和hec1b)中表达，并在调节细胞生长、存活、迁移/侵袭和相关基因方面发挥重要作用，如先前在源自其他实体瘤的癌细胞中观察到的那样。子宫内膜异位细胞也表达nr4a1，并且图1a中的结果表明，通过rna干扰(rnai)敲除nr4a1会降低源自患者的esect-7和esect-40子宫内膜异位细胞的生长。如图1b所示，两种寡核苷酸的敲除效率》85％，并且在nr4a1损失的同时，促生长基因egfr和cmyc的表达降低(图1c)。我们还观察到，在子宫内膜异位细胞中敲除nr4a1会降低促存活生存素和bcl-2基因产物的表达，并诱导bax、半胱天冬酶-3和parp(这些都是细胞凋亡的标记物)切割(图1d)。此外，nr4a1敲除还在esect-7和esect-40细胞中诱导膜联蛋白v染(图1e)，并且这些结果与先前在子宫内膜癌细胞中观察到的结果相当。
[0153]
实施例3：双吲哚衍生的nr4a1配体：反式激活和功能
[0154]
我们先前的研究确定了1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(dim-d-pphoh，cdim8)作为nr4a1拮抗剂，并且我们还开发了若干支持的(3,5-取代的)cdim8类似物，以减少羟基基团的体内代谢(缀合)并增强活性。图2a中的结果表明，cdim8和3,5-二溴(4-oh-3,5-br2)、3-氯-5-甲氧基(4-oh-3-cl-3-och3)和3-氯-(4-oh-3-cl)支持的dim-c-pphoh类似物抑制gal4-nr4a1和nr4a1在用gal4-nr4a1嵌合体/上游激活序列(uas)-荧光素酶(luc)和nr4a1/ngfi-b应答元件(nbre)-luc构建体转染的esect-7细胞中的内在转录活性。uas-luc构建体含有五个串联的gal4结合位点，并且nbre-luc构建体含有结合nr4a1的nbre位点。同一组化合物降低了nr4a1在esect-40细胞中的内在转录活性(图2b)。因此，双吲哚衍生的nr4a1拮抗剂有效地抑制nr4a1在人子宫内膜异位细胞和子宫内膜癌细胞中的内在转录活性。nr4a1配体衍生物的比较分析表明，与其他nr4a1配体相比，dim-c-pphoh-3-cl-5-och3有效地抑制nr4a1的内在转录活性。例如，与15μm-25μm的dim-c-pphoh相比，5μm-10μm的dim-c-pphoh-3-cl-5-och3有效地抑制esect-7和esect-40细胞的生长(图2c)并下调同一细胞系中egfr和cmyc的表达(图2d)。此外，与25μm dim-c-pphoh相比，10μm dim-c-pphoh-3-cl-5-och3在esect-7(图3a)和esect-40(图3b)细胞中显著诱导膜联蛋白v染。与25μm dim-c-pphoh相比，5μm dim-c-pphoh-3-cl-5-och3处理还在esect-7和esect-40细胞中显著诱导若干细胞凋亡标记物，包括生存素和bcl-2的下调，并诱导bax和切割的parp和半胱天冬酶-3(图3c)。
[0155]
然而，与人子宫内膜异位基质细胞(esect)相比，15μm-25μm dim-c-pphoh和5-10μm dim-c-pphoh-3-cl-5-och3处理不抑制正常子宫内膜nem细胞的生长(图4a)并且与dmso对照相比不降低cmyc和egfr表达(图4b)。此外，与dmso对照相比，25μm dim-c-pphoh和10μm dim-c-pphoh-3-cl-5-och3处理也不增强膜联蛋白v染(图4c)、nem细胞中切割形式的parp和bax的水平(图4d)。nem细胞也表达nr4a1，然而，nr4a1拮抗剂表现出细胞环境依赖性效果并且不影响这些细胞，并且对于选择性受体调节剂通常观察到这种细胞依赖性特异
性，这些选择性受体调节剂不仅依赖于受体而且还依赖于可能在细胞系之间有所不同的特定辅因子的表达。
[0156]
先前对源自基质的子宫内膜异位细胞的研究表明，nr4a1的敲除增强了人异位子宫内膜基质细胞(eesc)和正常子宫内膜基质细胞(nesc)中tgfβ1诱导的纤维化基因表达。为了验证这一观察结果，我们在esect-7子宫内膜异位基质细胞中抑制nr4a1的内在转录活性(图5a)并通过sinr4a1降低nr4a1水平(图5b)，然后确定纤维化的进展。与对照相比，nr4a1的抑制降低了esect-7细胞中sma的表达水平(图5a和图5b)。与dmso对照相比，除了sma之外，20μm-25μm dim-c-pphoh和5μm-10μm dim-c-pphoh-3-cl-5-och3也降低了esect-7细胞中纤维化标记物(诸如fn、col1a1和ctgf)的mrna水平(图5c)。
[0157]
实施例4：nr4a1拮抗剂在子宫内膜异位细胞对比子宫内膜癌细胞的纤维化中的作用。
[0158]
为了验证nr4a1在人子宫内膜细胞的纤维化进展中的功能，我们采用永生化人子宫内膜上皮细胞(iheec)作为正常人子宫内膜上皮细胞，因为iheec在scid小鼠中未转化(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1892381/)。作为对照，我们采用源自上皮的ishikawa子宫内膜癌细胞，因为nr4a1抑制剂阻止ishikawa细胞的生长和存活。与对照相比，nr4a1的敲除(图6a)以及dim-c-pphoh和dim-c-pphoh-3-cl-5-och3处理(图6b)降低了iheec中纤维化标记物(α-sma、col1a1、fn和ctgf)的表达。nr4a1的敲除(图6c)以及dim-c-pphoh和dim-c-pphoh-3-cl-5-och3处理(图6d)也降低了ishikawa细胞中纤维化标记物(α-sma、col1a1、fn和ctgf)的表达。因此，nr4a1的激活会刺激子宫内膜异位症的纤维化进展，如在子宫内膜上皮癌细胞系中所观察到的。
[0159]
实施例5：与正常子宫相比，子宫内膜异位组织中nr4a1的表达水平有所升高。
[0160]
为了确定与正常子宫内膜相比，子宫内膜异位组织中nr4a1的表达水平是否升高，我们采用自体移植法通过手术将子宫内膜异位症诱导到小鼠中。在子宫内膜异位症诱导后第3周的发情期，从患有子宫内膜异位症的小鼠中分离出异位病变和在位子宫内膜。作为对照，我们还分离了处于不患有子宫内膜异位症的雌性小鼠(10周龄)发情期的子宫。
[0161]
利用nr4a1抗体的免疫组织化学(ihc)显示，与子宫的上皮相比，异位病变的上皮中的nr4a1水平显著升高(2.6倍，p《0.001)(图7a、图7c和图7d)。除了异位病变外，与正常子宫的上皮相比，在位子宫内膜的上皮中的nr4a1水平也升高(1.27倍，p＝0.002)(图7a、图7b和图7d)。因此，与正常子宫的上皮相比，患有子宫内膜异位症的小鼠的异位病变和在位子宫内膜的上皮具有更高水平的nr4a1。除了上皮之外，与子宫的基质相比，异位病变的基质中的nr4a1水平略有升高(1.1倍，p＝0.012)(图7e)。然而，与正常子宫的基质相比，在位子宫内膜的基质中的nr4a1水平未升高(图7e)。总的来说，子宫内膜异位组织中nr4a1水平的升高与子宫内膜异位症进展有关。
[0162]
实施例6：dim-c-pphoh-3-cl-5-och3处理有效抑制患有子宫内膜异位症的小鼠的异位病变的生长。
[0163]
尽管与正常子宫相比，异位病变中nr4a1的表达水平显著升高，但尚不清楚nr4a1的升高是否诱导子宫内膜异位症或仅仅是子宫内膜异位症的结果。为了解决这个问题，我们采用nr4a1特异性拮抗剂dim-c-pphoh-3-cl-5-och3来研究异位病变中nr4a1的抑制是否会抑制患有子宫内膜异位症的小鼠的子宫内膜异位症每日进展。基于我们先前的研究，我
们每天用25mg/kg dim-c-pphoh-3-cl-5-och3和溶媒对照患有子宫内膜异位症的小鼠(图8a)。与溶媒相比，25mg/kg dim-c-pphoh-3-cl-5-och3处理显著减小(2.4倍，p＝0.015)异位病变的体积(图8b、图8c和图8d)。然而，与溶媒相比，dim-c-pphoh-3-cl-5-och3处理未改变小鼠的体重(图8e)。因此，dim-c-pphoh-3-cl-5-och3处理有效抑制患有子宫内膜异位症的小鼠的小鼠异位病变的生长，而副作用很小。
[0164]
上述观察结果提出以下问题：dim-c-pphoh-3-cl-5-och3是否也抑制人异位病变的生长。为了解决这个问题，我们用携带荧光素酶基因的hec将子宫内膜异位症诱导到scid小鼠体内。用25mg/kg dim-c-pphoh-3-cl-5-och3处理具有人异位病变的小鼠，对比溶媒处理作为对照(图9a)。除了小鼠异位病变之外，与溶媒图像相比，dim-c-pphoh-3-cl-5-och3处理也显著降低异位病变中的荧光素酶活性(13.4倍，p＝0.022)(图9b和图9c)。由于荧光素酶活性概括了小鼠的人异位病变的生长，因此与溶媒相比，采用nr4a1拮抗剂的dim-c-pphoh-3-cl-5-och3处理抑制了scid小鼠的人异位病变的生长，并证实了nr4a1拮抗剂作为子宫内膜异位症抑制剂的体内功效。
[0165]
缩写：
[0166]
●
c-dim，亚甲基取代的二吲哚甲烷；
[0167]
●
colia1，α1型胶原蛋白；
[0168]
●
ctgp，结缔组织生长因子；
[0169]
●
dab，二氨基联苯胺；
[0170]
●
dim，3,3'-二吲哚甲烷；
[0171]
·
dim-c-pphoh，1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-羟基苯基)甲烷；
[0172]
·
egfr，表皮生长因子受体；
[0173]
·
fn，纤连蛋白；hec，人子宫内膜细胞；
[0174]
·
ihc，免疫组织化学；
[0175]
·
nbre，神经生长因子β应答元件；
[0176]
·
nr4a，核受体4a；
[0177]
·
lihesc，荧光素酶稳定的永生化人子宫内膜细胞；
[0178]
●
pbs，磷酸盐缓冲盐水；
[0179]
·
pvdf，聚偏二氟乙烯；
[0180]
·
sma，平滑肌肌动蛋白。
[0181]
应当理解，除非明确说明，否则提供用于本公开的任何方面的任何实施方案、特征、要素、定义或一般描述可不受限制地应用于本公开的任何其他方面。因此，本文讨论的任何实施方案可相对于本发明的任何方法、药剂或组合物来实施，反之，本发明的任何方法、药剂或组合物可相对于本文讨论的任何实施方案来实施。此外，本发明的药剂和组合物可用于实现本发明的方法。
[0182]
当与本文的术语“包括”结合使用时，词语“一个”或“一种”的使用可表示“一个(种)”，但是它也与“一个(种)或多个(种)”、“至少一个(种)”和“一个(种)或一个(种)以上”的含义一致。
[0183]
术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代物或替代物是相互排斥的，尽管本公开支持仅指替代物和“和/或”的定义。
[0184]
在整个本技术中，术语“约”用于表示一个值包括设备的固有误差变化、用于确定该值的方法或研究受试者之间存在的变化。
[0185]
术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式连接动词。这些动词中的一者或多者的任何形式或时态，诸如“包含(comprises/comprising)”、“具有(has/having)”和“包括”(includes/include)也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅拥有那些一个或多个步骤，并且还涵盖其他未列出的步骤。除了“包括”之外，或者作为替代，本文的任何实施方案都可引用“由
……
组成”。连接词“由
……
组成”排除权利要求书中未指定的任何要素、步骤或成分。使用单数或复数的词语也分别包括复数和单数。此外，当在本技术中使用时，词语“本文”、“以上”和“以下”以及类似含义的词语应当指本技术作为一个整体，而不是本技术的任何特定部分。
[0186]
本文引用的出版物和所引用的主题全文据此具体地以引用方式并入。
[0187]
尽管已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是应当理解，可在不脱离本发明的实质和范围的情况下进行各种改变。

技术特征：

1.一种通过调节核受体亚科4组a成员1(nr4a1)活性来个体的子宫内膜异位症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的下式的化合物：或其盐，其中，r1、r2、r1'和r2'各自独立地选自氢、含有一至约十个碳原子的直链烷基基团和含有一至约十个碳原子的支链烷基基团；r3、r4、r5、r6、r3'、r4'、r5'和r6'各自独立地选自氢、卤素、含有一至约十个碳原子的直链烷基基团、含有一至约十个碳原子的支链烷基基团、含有一至约十个碳原子的烷氧基基团和硝基基团；r7选自氢、含有一至约十个碳原子的直链烷基基团、含有一至约十个碳原子的支链烷基基团、含有一至约十个碳原子的环烷基基团和芳基基团；r8、r9、r
10
、r
11
和r
12
独立地选自h、卤素、含有一至约十个碳原子的直链烷基基团、含有一至约十个碳原子的支链烷基基团、含有一至约十个碳原子的烷氧基基团、含有一至约十个碳原子的卤代烷基基团、硝基基团、羟基基团和含有一至约十个碳原子的卤代烷氧基基团；其中r8、r9、r
10
、r
11
和r
12
中的至少一者为oh，并且其中当r
10
为oh时，r8、r9、r
11
和r
12
中的至少一者不是氢。2.根据权利要求1所述的方法，其中r8为oh。3.根据权利要求2所述的方法，其中r9、r
10
、r
11
和r
12
各自为h。4.根据权利要求2所述的方法，其中r9、r
10
、r
11
和r
12
独立地选自卤素、ch3、occl3、cf3、叔丁基、och3、oh、c6h5和cn。5.根据权利要求2所述的方法，其中r
10
为och3。6.根据权利要求2所述的方法，其中r
11
选自ch3、och3和cf3。7.根据权利要求2所述的方法，其中r9和r
11
为br。8.根据权利要求2所述的方法，其中所述化合物选自：
以及它们的盐。9.根据权利要求1所述的方法，其中r9为oh。10.根据权利要求9所述的方法，其中r8、r
10
、r
11
和r
12
各自为h。
11.根据权利要求9所述的方法，其中r8、r
10
、r
11
和r
12
独立地选自卤素、ch3、occl3、cf3、叔丁基、och3、oh、c6h5和cn。12.根据权利要求9所述的方法，其中r8为卤素。13.根据权利要求9所述的方法，其中所述化合物选自：化合物选自：以及它们的盐。14.根据权利要求1所述的方法，其中r
10
为oh。15.根据权利要求14所述的方法，其中r8、r9、r
11
和r
12
独立地选自卤素、ch3、occl3、cf3、叔丁基、och3、oh、c6h5和cn。16.根据权利要求14所述的方法，其中r9为卤素并且r
11
选自h、卤素和och3。17.根据权利要求14所述的化合物，其中所述化合物选自：
以及它们的盐。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中nr4a1的调节诱导选自efgr、cmyc、生存素、bcl-2、sma以及它们的组合的蛋白质的下调。19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中nr4a1活性的调节诱导包括bax在内的蛋白质的上调。20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中nr4a1活性的调节诱导选自fn、col1a1、ctgf以及它们的组合的纤维化标记物的mrna水平降低。21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中nr4a1活性的调节切割parp和半胱天冬酶-3。22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中nr4a1活性的调节在卵巢子宫内膜瘤中诱导细胞凋亡。23.根据权利要求22所述的方法，其中相对于对照，nr4a1活性的调节不抑制正常子宫内膜细胞的生长。24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中nr4a1活性的调节抑制纤维化的进展。25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中相对于对照，nr4a1活性的调节抑制nr4a1在子宫内膜异位细胞中的内在转录活性。26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中相对于对照，nr4a1活性的调节抑制异位病变的生长。

技术总结

本发明描述了通过调节核受体亚科4组A成员1(NR4A1)活性来子宫内膜异位症的方法，这些方法包括向对其有需要的个体施用NR4A1配体。在一个实施方案中，化合物包括亚甲基取代的二吲哚甲烷。的二吲哚甲烷。的二吲哚甲烷。

技术研发人员：

S

受保护的技术使用者：

得克萨斯农业及机械体系综合大学

技术研发日：

2021.02.24

技术公布日：

2022/12/15