(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010531190.5
(22)申请日 2020.06.11
(71)申请人 四川大学
地址 610065 四川省成都市武侯区一环路
南一段24号
(72)发明人 黄园 吴蕾
(51)Int.Cl.
A61K 47/46(2006.01)
A61K 38/28(2006.01)
A61K 9/00(2006.01)
A61P 3/10(2006.01)
(54)发明名称
送系统
(57)摘要
本发明公开了一种包载蛋白多肽类药物的
外泌体口服递送系统及其应用。研究发现，通过
超声方法可将蛋白多肽类药物导入外泌体中，
外泌体无需任何修饰即能较快地穿过黏液层，通过
主动靶向作用高效进入细胞，在胞内实现药物的
内涵体-溶酶体逃逸，并具有较高的上皮细胞基
底侧出胞效率，最终表现出良好的体内递药效
率。本发明展示了一种简单、高效且安全的口服
递药系统，在医药领域具有良好的研究和开发应
用前景。权利要求书1页 说明书6页 附图4页CN 111569082 A 2020.08.25
C N 111569082
A
1.一种包载蛋白多肽类药物的载药外泌体，其特征在于，将蛋白多肽类药物包载于外泌体内获得，所述载蛋白多肽类药物外泌体用于口服递药。
2.根据权利要求1所述的载药外泌体，其特征在于，所述外泌体来源于牛奶、羊奶、人乳、血液、体液、组织、体外培养的细胞中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的载药外泌体，其特征在于，所述蛋白多肽类药物选自胰岛素、胰岛素类似物、奥曲肽、醋酸亮丙瑞林、降钙素、胸腺五肽、促黄体生成素释放激素、醋酸替可克肽、布舍瑞林、艾塞那
肽、胰高血糖素样肽-1、醋酸曲普瑞林、白细胞生长因子、红细胞生长因子、巨噬细胞生长因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、白细胞介素、血管生成抑制素、牛血清白蛋白、卵清蛋白、甲状旁腺素、生长激素、生长抑素、干扰素和单克隆抗体中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的载药外泌体，其特征在于，所述蛋白多肽类药物质量占载药外泌体总质量的0.1%~90%（w/w ）。
5.一种根据权利要求1-4所述的载药外泌体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）通过超高速离心法提取外泌体；
（2）将药物溶液与外泌体分散液按一定比例混合均匀；
（3）通过超声法将药物包载于外泌体中，并采用超滤法除去未包裹的游离药物。
6.一种用于克服胃肠道多重吸收屏障的制剂，其特征在于，由上述权利要求1-4任一项所述的载药外泌体或由权利要求5所述制备方法制备得到的载药外泌体与药学上可以接受的辅料制备成口服给药制剂。
7.权利要求1-4任一项载药外泌体在制备用于克服胃肠道多重吸收屏障的制剂中的用途。
权 利 要 求 书1/1页CN 111569082 A
一种包载蛋白多肽类药物外泌体的口服递送系统
技术领域
[0001]本发明涉及一种包载蛋白多肽类药物的外泌体的制备方法及口服递送中的应用，属于药物制剂领域。
背景技术
[0002]蛋白多肽类药物具有胃肠道稳定性差、透膜性低等特点，难以实现口服给药。纳米递药系统能够有效提高大分子蛋白多肽类药物的胃肠道稳定性，并能有效控制药物的释放，因而被广泛用于口服递药的研究。为将药物高效递送至血液循环，纳米递药系统需跨过肠道多重吸收屏障，包括黏液扩散屏障、肠上皮细胞顶侧膜入胞屏障和基底侧出胞屏障(Adv Drug Deliv Rev2018,124,1-2)。目前，针对克服黏液扩散屏障与入胞屏障的手段较多，但纳米递药系统从基底侧出胞的效率往往较低，极大地限制了蛋白多肽类药物的口服生物利用度(Drug Discov Today2016,21,856-863)。
[0003]纳米递药系统由肠上皮细胞基底侧“出胞难”的原因主要包括：(1)纳米粒入胞后进入内涵体/溶酶体，其中的酸性环境和大量水解酶使药物稳定性降低，并且一定程度降低了纳米粒的出胞速率；(2)受肠上皮细胞极性的影响，较大部分药物由顶侧膜外排返回肠腔，而非由基底侧转运至血液循环。为解决上
述问题，有研究者利用内涵体逃逸肽或阳离子材料帮助纳米粒与药物实现内涵体逃逸(ACS Appl Mater Interfaces 2018,10,9315-9324；J Control Release,2011,151,220-228)。然而经典的逃逸肽在胃肠道的稳定性较差，限制了逃逸作用的发挥；而帮助逃逸的阳离子材料的毒性和免疫原性较大，不利于长期口服给药。为提高基底侧出胞效率，有研究者将靶向低密度脂蛋白受体(LDLR)的纳米粒与LDLR信号通路调节剂共同给药(Nanoscale 2018,10,1494-1507)，但仍未解决安全性问题，且递药体系较为复杂。
[0004]天然来源的生物材料具有免疫原性低、生物相容高的优点。外泌体是一类细胞外囊泡，被认为是天然的“特洛伊木马”，其中包载着多种内源性、具有生理活性的大分子物质(如DNA、miRNA、mRNA和蛋白)(Adv Mater 2019,31,e1802896)。外泌体与受体细胞之间可以进行有效的物质交换，将其中的大分子物质递送至胞内，实现细胞间信号传导。在注射给药途径中，外泌体被用作核酸类药物的新型递送载体，外泌体的包载可显著提高siRNA、mRNA 等药物的效果(J Control Release 2019,308,119-129；Nat Biomed Eng2020,4,69-83)。近年来的研究表明，外泌体中内源性或导入的外源性大分子物质，如CD63、存活蛋白siRNA等，能够实现溶酶体逃逸，进入受体细胞的胞质中(J Control Release2019,311,43–49；J Virol 2018,92,e01578-18；ACS Nano 2020,14,4,4444-4455)。但上述基于外泌体的递送系统是通过注射途径给药。此外，采用传统的电致孔法或药物外泌体共孵育方法，将蛋白多肽类药物包载入外泌体中的效率较低。因此，将外泌体作为蛋白多肽类药物的口服递送载体还未见报道。
发明内容
[0005]为了解决上述现有研究中口服递药系统存在的问题，本发明人通过创造性的研究首次将外泌体作为蛋白多肽类药物的纳米递送载体。
[0006]本发明的目的之一是提供，一种基于载蛋白多肽类药物外泌体的口服递药系统，在克服肠道吸收屏障的药物组合物/药物制剂中的应用。
[0007]作为具体的实施方案之一，所述载药外泌体平均粒径范围约50-200nm；所述蛋白多肽类药物质量占载药外泌体总质量的0.1％～90％(w/w)。
[0008]外泌体来源包括但不限于：牛奶、羊奶、乳汁、血液、体液、组织、体外培养的细胞的一种或多种的组合。
[0009]本发明的实施例中进一步优选牛奶来源的外泌体作为蛋白多肽类药物的载体。[0010]作为优选的实施方案之一，所述蛋白多肽类药物质量占载药外泌体总质量的0.1％～90％(w/w)，优选1％～80％(w/w)；
[0011]所述蛋白多肽类药物包括但不限于：胰岛素、胰岛素类似物、奥曲肽醋酸亮丙瑞林、降钙素、胸腺五肽、促黄体生成素释放激素、醋酸替可克肽、布舍瑞林、艾塞那肽、胰高血糖素样肽-1、醋酸曲普
瑞林、白细胞生长因子、红细胞生长因子、巨噬细胞生长因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、白细胞介素、血管生成抑制素、牛血清白蛋白、卵清蛋白、甲状旁腺素、生长激素、生长抑素、干扰素、单克隆抗体和疫苗。
[0012]作为本发明具体实施方案之一，优选胰岛素作为活性成分。
[0013]本发明目的之一是提供一种可用于制备口服给药的载药外泌体的方法，包括以下步骤：
[0014](1)通过超高速离心法提取外泌体；
[0015](2)将药物溶液与外泌体分散液按一定比例混合均匀；
[0016](3)通过超声法将药物包载于外泌体中，并采用超滤法除去未包裹的游离药物。[0017]作为具体的实施方案之一，包括以下步骤：
[0018](1)通过超高速离心法提取低脂牛奶中的外泌体；
[0019](2)将胰岛素水溶液与外泌体分散液按一定比例混合均匀，其中胰岛素与外泌体的质量比为1:99～95:5(w/w)；
[0020](3)通过超声法将胰岛素包载于牛奶来源外泌体中，其中超声功率为10～200W，超声时间为0.1～10min；
[0021]本发明目的之一是提供一种可克服胃肠道吸收屏障的纳米制剂，主要是由本发明的载药外泌体与药学上可以接受的辅料制备成溶液型液体制剂、高分子溶液剂、乳剂、混悬剂、糖浆剂、滴剂、散剂、颗粒剂、片剂及胶囊剂等口服给药制剂。
[0022]有益效果
[0023] 1.本发明中的蛋白多肽类药物包载于外泌体中，其在胰蛋白酶中稳定性显著提高，在人工胃液与人工肠液中释放较为缓慢，无明显突释。
[0024] 2.本发明中的外泌体可快速穿过肠道黏液层，到达上皮细胞表面，并通过靶向肠道上皮细胞多种转运体，有效提高细胞摄取与跨膜转运效率。
[0025] 3.本发明中的外泌体能够有效从内涵体和溶酶体中逃逸，将蛋白多肽类药物递送至胞质，提高了药物稳定性。
[0026] 4.本发明中的外泌体具有较高的上皮细胞基底侧出胞效率，有助于提高所包载的蛋白多肽类药物跨过肠上皮细胞单层，进入血液循环。
[0027] 5.本发明中的外泌体的体内递药效率高，显著提高蛋白多肽类药物的口服生物利用度。
[0028] 6.本发明中的外泌体无需其他修饰即可跨过肠道多重吸收屏障，包括黏液扩散屏障、上皮细胞顶侧膜入胞屏障、内涵体-溶酶体屏障和基底侧出胞屏障，有效改善蛋白多肽类药物的口服效果。该递药体系制备简便，且生物相容性良好，有利于实现大规模生产与临床转化。
附图说明
[0029]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0030]图1表示牛奶来源外泌体(EXO)与载胰岛素牛奶来源外泌体(EXO@INS)的表征。[0031]图2表示与胰蛋白酶孵育时EXO@INS中胰岛素含量变化图。
[0032]图3表示EXO在肠道黏膜的覆盖率研究图。
[0033]图4表示EXO与传统穿黏液型纳米粒的跨膜效率研究图。
[0034]图5表示EXO主动靶向肠上皮细胞能力的研究图。
[0035]图6表示EXO使其包载的荧光标记胰岛素实现内涵体和溶酶体逃逸的研究图。[0036]图7表示EXO由肠上皮细胞顶侧和基底侧出胞速率的研究图。
[0037]图8表示I型糖尿病大鼠口服EXO@INS、EXO与胰岛素原药后的药效学研究图。
具体实施方式
[0038]以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。
[0039]实施例1牛奶来源外泌体(EXO)与载胰岛素牛奶来源外泌体(EXO@INS)的制备与表征
[0040]首先，采用超高速离心法分离低脂牛奶中的EXO。具体方法为，将低脂牛奶离心(13,000×g，30min)，上清液与500mM的乙二胺四乙酸水溶液(调pH至7.0)混合均匀(3:1,v/ v)，冰浴静置15min，高速离心(100,000×g，60min，4℃)除去脂肪颗粒，沉淀蛋白质与较大囊泡。将上清液继续离心(135,000×g，90min，4℃)，向沉淀中加入磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)，吹打分散，0.22μm无菌滤器过滤，得到EXO分散液。采用BCA法定量EXO总蛋白浓度，分装置于-80℃待用。
[0041]接下来，采用超声法制备EXO@INS。具体方法为，将INS溶于0.1M盐酸，加入NaOH调节pH至7左右，配制INS储备液(8mg/ml)。INS溶液与EXO(1mg/ml)等体积混合，探头超声。超声功率为100W，
时间为3min(2s/2s，开/关)。采用超滤法除去未包裹的INS，向EXO@INS中加入适宜溶剂分散。向EXO@INS分散液中加入等体积1％Triton X-100，利用高效液相谱(HPLC)法测定INS含量，按如下公式计算载药量：
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