一种异甘草素与抗生素联合药物组合物及其用途

1.本发明涉及中药与抗生素联合应用技术领域，具体说，是一种异甘草素与抗生素联合药物组合物及在制备抗耐甲氧西林金黄葡萄球菌药物中的用途。

背景技术：

2.耐甲氧西林金黄葡萄球菌(mrsa)是三大常见的耐药菌之一，对多种抗生素高度耐药，广泛分布在医院、社区中，可引起反复发作性皮肤软组织感染、菌血症、坏死性肺炎等疾病。糖肽类抗生素万古霉素、噁唑烷酮类抗生素利奈唑胺等是目前mrsa感染的一线药物，不幸的是，抗生素的过度使用导致许多地区已出现对万古霉素耐药的菌株，因此急需开发新的抗菌药物或方法来缓解当前紧张的局面。在过去抗mrsa新药开发中，大多数研究通过修饰现有抗菌药物的结构，研制直接抗菌的抗生素，所开发的新药往往由于抗菌活性弱或毒性大而止步于实验室研究。因此寻新的活性强且毒性低的抗菌药物具有重要意义。目前，联合是最具前途的防治办法，药物联用能够降低抗生素的毒副作用和用量，从而降低细菌耐药性的产生。
3.头孢西丁(cefoxitin)是β-内酰胺类中的头霉素类抗生素，白至灰白结晶粉末，其抗菌作用机制是通过与细菌细胞一个或多个青霉素结合蛋白(pbps)结合，抑制细菌分裂活跃细胞的胞壁合成，从而起抗菌作用。庆大霉素(gentamicin)是氨基糖苷类抗生素，透明琥珀液体，其抗菌作用机制是作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌蛋白质合成，并破坏细菌细胞膜的完整性。
4.异甘草素是从甘草属植物分离、纯化的异黄酮类化合物，是黄针状结晶，难溶于水，可溶于乙醚和dmso液等极性较小的溶剂。异甘草素已被证实有很多药理活性，包括抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌、免疫调节、肝保护和心脏保护等作用。有研究表明，异甘草素对金黄葡萄球菌具有较好的抗菌活性，并且异甘草素与β-内酰胺类中的青霉素类抗生素联用时可以逆转mrsa的耐药性。然而，异甘草素联合头孢西丁、庆大霉素增强mrsa敏感性，逆转耐药的作用尚未报道。

技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是，提供一种异甘草素与抗生素联合药物组合物及其用途，异甘草素与头孢西丁或庆大霉素联合应用，从而增强抗生素疗效，对抗mrsa耐药性，为mrsa感染提供新的策略。
6.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种异甘草素与抗生素联合药物组合物，活性成分由异甘草素与抗生素组成，所述抗生素为头孢西丁或庆大霉素。
7.所述异甘草素与头孢西丁联合药物组合，质量比为(0.039—0.078)：(0.00025—0.004)；异甘草素与庆大霉素联合药物组合，质量比为(0.00975—0.078)：(0.000975—0.00781)。
8.优选，所述甘草素与头孢西丁联合药物组合，质量比为0.039：0.002；异甘草素与
庆大霉素联合药物组合，质量比为(0.0195—0.039):(0.0019525—0.003905)。
9.还包括药学上可接受的载体，制成片剂、颗粒剂、胶囊、注射剂、控释制剂等剂型。
10.上所述的异甘草素与抗生素联合药物组合物在制备抗耐甲氧西林金黄葡萄球菌药物中的用途。
11.本发明的有益效果是：本发明的异甘草素与头孢西丁或庆大霉素联合应用能够显著降低抗生素的毒副作用和用量，具有较强的抗mrsa活性，甚至能够逆转耐药性，显示了较好的协同抗菌效果；异甘草素能提高β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素的抗菌作用，可为寻抗菌增敏化合物提供参考。
附图说明
12.图1为异甘草素与头孢西丁联合给药四天大鼠肺部细菌载量图(
***
p《0.001，与模型组相比)；
13.图2为异甘草素与头孢西丁联合给药六天大鼠肺部细菌载量图(
***
p《0.001，与模型组相比)。
具体实施方式
14.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.本发明的异甘草素与抗生素联合药物组合物，活性成分由异甘草素与抗生素组成，所述抗生素为头孢西丁或庆大霉素。
16.所述异甘草素与头孢西丁联合药物组合，质量比为(0.039—0.078)：(0.00025—0.004)；异甘草素与庆大霉素联合药物组合，质量比为(0.00975—0.078)：(0.000975—0.00781)。
17.优选，所述甘草素与头孢西丁联合药物组合，质量比为0.039：0.002；异甘草素与庆大霉素联合药物组合，质量比为(0.0195—0.039):(0.0019525—0.003905)。
18.还包括药学上可接受的载体，制成片剂、颗粒剂、胶囊、注射剂、控释制剂等剂型。
19.上所述的异甘草素与抗生素联合药物组合物在制备抗耐甲氧西林金黄葡萄球菌药物中的用途。
20.下面通过采取异甘草素联合头孢西丁、庆大霉素对mrsa敏感性的静态研究；异甘草素联合头孢西丁对mrsa大鼠肺炎的作用进行详细说明。
21.本发明所述的异甘草素是从中药甘草中提取分离获得或人工方式合成，可采用任何已公开文献或专利方法提取制备。本发明所述的静态研究是棋盘法中的微量棋盘稀释法，是最常用的联合用药筛选方法之一。微量棋盘稀释法以药物的最低抑菌浓度为最高浓度进行稀释，力图到两种药物在亚抑菌浓度下仍能表现出较强抑菌活性的组合。本发明所述的fic值是联合抑菌指数值，是对两种药物联合药敏作用的评价指标。两种抗菌药同时使用时，可出现显著协同、部分协同、相加、无关和拮抗五种情况，其判读标准：fic≤0.5，显著协同效应；fic为0.5-1，部分协同效应；fic＝1，相加效应；fic》1-4，无关效应；fic≥4，拮
抗效应。本发明所述的肺炎是mrsa感染的细菌性肺炎，其发生受患者年龄、免疫力、基础病、抗生素使用史等状况的影响。本发明采取气管穿刺法构建mrsa感染大鼠肺炎模型，该方法能够直接将细菌注入大鼠肺部，且剂量准确。
22.实施例1异甘草素联合头孢西丁、庆大霉素对mrsa敏感性的静态效果
23.1、实验菌种：耐甲氧西林金黄葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus)atcc 43300
24.2、主要试剂：注射用头孢西丁钠(广州白云山天心制药股份有限公司)；庆大霉素注射液(新乡市常乐制药有限公司)；磷酸盐缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)；mhb培养基(北京索莱宝科技有限公司)
25.3、实验方法：分别将浓度为64mg/ml的头孢西丁，40mg/ml的庆大霉素，50mg/ml的异甘草素三种药物加入灭菌mhb培养基溶解并加适量的二甲基亚砜助溶，配置成一系列稀释浓度的药液。采用棋盘设计法将相应的两种药物混合并加于96孔板中，每个孔板同时设置药物组、菌液阳性对照组、菌液阴性对照组，按照以下加样顺序依次加入样品：首先各组分别加入70μlmhb培养基，其次混合药物组和混合药物对照组分别加入20μl不同浓度的药液；菌液组、阴性对照组分别加入20μl药液溶剂。最后混合药物组和菌液组分别加入10μl菌悬液；混合药物对照组、阴性对照组加入10μlpbs缓冲液。全部加样后，将96孔板置于35℃培养箱培养，18h后记录各孔中溶液是否澄清，并测定其在590nm处的吸光度。以上实验重复三次。
26.4、数据处理：按照下述公式(1、2)计算抑菌率，并根据两种药物联合应用时的最低抑菌浓度按照公式(3)计算相应的fic值。
27.od
变化量
＝od
药物组-od
药物对照组
ꢀꢀꢀꢀ
(公式1)
[0028][0029][0030]
5、实验结果：将抑菌率≥90％的浓度作为两药物联合应用时最低抑菌浓度并计算fic值见表1至表4。
[0031]
表1异甘草素联合头孢西丁对mrsa的抑菌作用
[0032][0033][0034]
注：—：表示未检测
[0035]
表2异甘草素与头孢西丁的联合抗菌作用
[0036][0037]
由表1可知，浓度为0.001mg/ml头孢西丁与浓度为0.039mg/ml异甘草素；浓度为0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.004mg/ml头孢西丁与浓度为0.0195mg/ml异甘草素是无效配伍组合。由表2可知，浓度为0.078mg/ml异甘草素与浓度为0.002mg/ml、0.001mg/ml、0.0005mg/ml、0.00025mg/ml头孢西丁；浓度为0.039mg/ml异甘草素与浓度为0.004mg/ml、0.002mg/ml头孢西丁，这六组药物组合物有协同作用，其中，异甘草素浓度为0.039mg/ml、头孢西丁浓度为0.002mg/ml时为最优药物组合。
[0038]
表3异甘草素联合庆大霉素对mrsa的抑菌作用
[0039][0040][0041]
注：—：表示未检测
[0042]
表4异甘草素与庆大霉素的联合抗菌作用
[0043][0044]
由表3可知，浓度为0.000488125mg/ml庆大霉素与浓度为0.078mg/ml异甘草素；浓度为0.00097625mg/ml庆大霉素与浓度0.039mg/ml的异甘草素；浓度为0.0019525mg/ml庆大霉素与浓度为0.0195mg/ml异甘草素；浓度为0.003905庆大霉素与浓度为0.00975mg/ml异甘草素；浓度为0.00781mg/ml庆大霉素与浓度为0.004875异甘草素是无效配伍组合。由表4可知，浓度为0.078mg/ml异甘草素与浓度为0.003905mg/ml、0.0019525mg/ml、
0.000975mg/ml庆大霉素；浓度为0.039mg/ml异甘草素与浓度为0.00781mg/ml、0.003905mg/ml、0.0019525mg/ml庆大霉素；浓度为0.0195mg/ml异甘草素与浓度为0.00781mg/ml、0.003905mg/ml庆大霉素；浓度为0.00975mg/ml异甘草素与浓度为0.00781mg/ml庆大霉素，这九组药物组合物有协同作用，其中，异甘草素浓度为0.039mg/ml、庆大霉素浓度为0.003905mg/ml；异甘草素浓度为0.039mg/ml、庆大霉素浓度为0.0019525mg/ml；异甘草素浓度为0.0195mg/ml、庆大霉素浓度为0.003905mg/ml这三组为最优药物组合。
[0045]
实施例2异甘草素联合头孢西丁对mrsa大鼠肺炎的作用
[0046]
1、实验材料：耐甲氧西林金黄葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus)atcc 43300；sd大鼠，spf级，体重200-220g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司；利奈唑胺片(pfizer pharmaceuticals llc)；rat il-6elisa kit(武汉博士德生物工程有限公司)；rat tnf-αelisa kit(武汉博士德生物工程有限公司)
[0047]
2、实验方法：除空白组外，其余大鼠用水合氯醛麻醉，剪开部分皮肤病分离出气管，从气管处注入培养好的菌液(0.8ml/kg)，缝合皮肤后，将大鼠保持直立状态轻晃数次，使菌液在两侧肺部分布均匀。阳性对照药利奈唑胺组(54mg/kg)，头孢西丁组(45mg/kg)，异甘草素(90mg/kg)，头孢西丁+异甘草素组(45mg/kg+45mg/kg)，空白对照组和模型组灌胃0.5％羧甲基纤维素钠，每个时间点每组5只。造模两天后，各组开始进行灌胃给药，给药量为1ml/100g，2次/天，分别在给药两天、四天、六天各组随机抽取五只大鼠进行后续实验处理。检测肺组织载菌量检测和大鼠血清中tnf-α、il-6含量。
[0048]
3、实验结果：给药四天各组大鼠肺部细菌载量结果见图1，给药四六天各组大鼠肺部细菌载量结果见图2。大鼠血清中tnf-α的含量变化见表6，大鼠血清中il-6的含量变化见表7。
[0049]
表5各组大鼠血tnf-α含量(pg/ml)
[0050][0051][0052]
注：与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001；与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001
[0053]
由表5可知，空白组tnf-α的含量在给药六天内无明显变化，与空白组相比，模型组tnf-α的含量均明显增高(p《0.05)。给药四天，利奈唑胺和异甘草素组tnf-α的含量开始降低(p《0.05)；给药六天，各给药组tnf-α的含量与模型组相比均显著降低(p《0.01)，其中利
奈唑胺、异甘草素、联合组tnf-α的含量与空白组相比无统计学差异(p》0.05)。
[0054]
表6各组大鼠血清il-6含量(pg/ml)
[0055][0056]
注：与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001；与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001
[0057]
由表6可知，空白组il-6含量在给药六天内无明显变化，模型组il-6的含量在给药六天内保持较高水平(p《0.001)。与模型组相比，给药两天，阳利奈唑胺组il-6的含量显著下降(p《0.001)，异甘草素和联合组il-6的含量降低，但无统计学差异(p》0.05)；给药四天，利奈唑胺组和联用组il-6的含量显著降低(p《0.001)，两单用药组无明显变化(p》0.05)；给药六天，利奈唑胺、头孢西丁、异甘草素和联用组il-6的含量均显著降低，其中联合组il-6的含量趋近于空白组(p》0.05)，但头孢西丁il-6的含量仍较高。
[0058]
4实验结论
[0059]
通过肺部细菌载量结果可知，异甘草素能够提高头孢西丁体内抑菌作用。各给药组对tnf-α和il-6的含量均呈不同程度的抑制，联合组对il-6的抑制作用更强。异甘草素联合头孢西丁能够缓解mrsa引起的细菌感染肺炎。
[0060]
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

技术特征：

1.一种异甘草素与抗生素联合药物组合物，其特征在于，活性成分由异甘草素与抗生素组成，所述抗生素为头孢西丁或庆大霉素。2.根据权利要求1所述的异甘草素与抗生素联合药物组合物，其特征在于，所述异甘草素与头孢西丁联合药物组合，质量比为(0.039—0.078)：(0.00025—0.004)；异甘草素与庆大霉素联合药物组合，质量比为(0.00975—0.078)：(0.000975—0.00781)。3.根据权利要求2所述的异甘草素与抗生素联合药物组合物，其特征在于，所述甘草素与头孢西丁联合药物组合，质量比为0.039：0.002；异甘草素与庆大霉素联合药物组合，质量比为(0.0195—0.039):(0.0019525—0.003905)。4.根据权利要求1—3任一项所述的异甘草素与抗生素联合药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体。5.如权利要求1-3任一项所述的异甘草素与抗生素联合药物组合物在制备抗耐甲氧西林金黄葡萄球菌药物中的用途。

技术总结

本发明公开了一种异甘草素与抗生素联合药物组合物及其用途，活性成分由异甘草素与抗生素组成，所述抗生素为头孢西丁或庆大霉素。异甘草素与头孢西丁或庆大霉素联合应用能够显著降低抗生素的毒副作用和用量，具有较强的抗MRSA活性，甚至能够逆转耐药性，显示了较好的协同抗菌效果；异甘草素能提高β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素的抗菌作用，可为寻抗菌增敏化合物提供参考，用于制备抗耐甲氧西林金黄葡萄球菌药物。西林金黄葡萄球菌药物。西林金黄葡萄球菌药物。