(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.08.20
C N 103998048
A (21)申请号 201280044164.3
(22)申请日 2012.07.11
10-2011-0068261 2011.07.11 KR
10-2011-0068761 2011.07.12 KR
A61K 35/44(2006.01)A61K 35/12(2006.01)C12N 5/074(2006.01)A61K 8/98(2006.01)A61P 17/00(2006.01)
(71)申请人车比奥及戴奥斯泰有限公司
地址韩国首尔市
(72)发明人崔容秀 金仙美 李荣濬
(74)专利代理机构北京市柳沈律师事务所
11105
代理人
闵丹
(54)发明名称
(57)摘要
分的方法。本发明提供包含有用成分的脐带提取
物。依照本发明，所述脐带提取物可用作血清替代
照本发明的脐带提取物可用于供组织修复的填充
剂和敷料，和用于供改进皮肤的化妆用组合物。另
外，本发明涉及用于分离和培养源自组织(如脐
带和脂肪组织)的干细胞的培养基组合物，和使
用其分离和培养源自所述组织的干细胞的方法。
(30)优先权数据
(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2014.03.11
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/KR2012/005514 2012.07.11
(87)PCT国际申请的公布数据
WO2013/009100 KO 2013.01.17
(51)Int.Cl.权利要求书2页 说明书14页
序列表4页 附图23页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书2页 说明书14页序列表4页 附图23页(10)申请公布号CN 103998048 A
1.一种制备哺乳动物脐带提取物的方法，所述方法包括：
切割脐带；
将该脐带放到缓冲液中；
搅动浸在缓冲液中的脐带；
并离心从所述搅动获得的产物以获得上清液。
2.依照权利要求1制备的脐带提取物。
3.权利要求2的脐带提取物，其中所述脐带提取物包含胰岛素样生长因子结合蛋白-7(IGFBP-7)、脂笼蛋白-1、CXCL14、瘦素R、IL-23、MIP-1a、血管生成素、血小板反应蛋白-2、IL-29和IL-4R的蛋白。
4.一种包含脐带提取物的血清替代物。
5.权利要求4的血清替代物，其中所述脐带提取物是依照权利要求1的方法制备的。
6.一种细胞培养基，其包含权利要求4的血清替代物。
7.权利要求6的细胞培养基，其中所述细胞是动物细胞。
8.权利要求7的细胞培养基，其中所述动物细胞是干细胞。
9.权利要求8的细胞培养基，其中所述干细胞是脐带来源的干细胞。
10.一种用于组织修复的填充剂，其包含脐带提取物。
11.权利要求10的用于组织修复的填充剂，其中所述脐带提取物是依照权利要求1的方法制备的。
12.一种从哺乳动物脐带分离干细胞的方法，所述方法包括：
将分块的脐带组织与包含哺乳动物脐带提取物的细胞培养基组合物放置到细胞培养容器中；
将所述脐带组织用酶处理；并
从所述脐带组织分离干细胞。
13.权利要求12的方法，其中所述细胞培养容器用细胞粘附蛋白包被。
14.权利要求12的方法，其中所述细胞粘附蛋白选自下组：哺乳动物胎盘来源的胶原、明胶、纤连蛋白、核纤层蛋白和聚-D-溶素。
15.一种培养干细胞的方法，所述方法包括：
向干细胞培养基添加脐带提取物；并
通过使用所述干细胞培养基在细胞培养容器中培养干细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述细胞培养容器用细胞粘附蛋白包被。
17.权利要求15的方法，其中所述干细胞是组织来源的干细胞。
18.权利要求16的方法，其中所述组织选自下组：脂肪、脐带、肝和骨膜。
19.权利要求15的方法，其中所述干细胞培养基不包含血清。
20.权利要求15的方法，其中所述细胞粘附蛋白选自下组：哺乳动物胎盘来源的胶原、明胶、纤连蛋白、核纤层蛋白和聚-D-溶素。
21.权利要求15的方法，其中所述干细胞是表达至少一种选自下组的基因的细胞：Oct4、Sox2、KLF4和Nanog。
22.权利要求15的方法，其中所述干细胞对于CD29、CD73、CD90、CD105和CD166是选择性阳性的，而对于CD34和CD45是选择性阴性的。
23.权利要求15的方法，其中当通过使用脐带提取物来培养所述干细胞时，所述干细胞甚至在传代培养
时均持续表达至少一种选自下组的基因：Oct4、Sox2、KLF4和Nanog，所述基因都是胚胎干细胞特异性基因。
脐带提取物的制备方法和使用方法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求在韩国知识产权局2011年7月12日提交的韩国专利申请No.10-2011-0068761和2011年7月11日提交的韩国专利申请No.10-2011-0068261的权益，这两者的公开内容均通过引用而完整并入本文。
发明领域
[0003] 本发明的一个或多个实施方案涉及制备脐带提取物的方法、脐带提取物的血清替代物、用于分离和培养干细胞的组合物、和填充剂(filler)用于伤口愈合的用途。[0004] 发明背景
[0005] 自建立身体外动物细胞培养系统以来，血清一直被常规用于促进动物细胞的增殖。已广泛用于原代细胞和稳定细胞系的存活和增殖的血清，是一种仅其部分组成已知的混合物，如此尚未完全了解细胞培养中血清的生物学活性。还有，胎牛血清(FBS)从胎牛收集，如此FBS具有风险因子如支原体、病毒、朊病毒、细菌促细胞分裂原、激素、外来蛋白质、生长因子和蛋白酶。此外，根据供应商的设备、
技术标准和生产批号，FBS组成的质量可能变化。已知迄今报告的基础培养基(basal media)能使特定细胞生长；代替血清使用的细胞生长因子、粘附因子等是昂贵的；且已知基础培养基中的生长和代谢物生产没有在包含血清的培养基中的那些那么稳定(Cruz J.H.等,Cytotechnology,26:59 -64(1998)和Hee-Chan Lee,A Basal medium in an Animal Cell Culture,Biotechnology News,2(3):242-252(1994))。
[0006] 还有，包括FBS在内的培养基常规用于连续培养处于未分化状态的成人干细胞，而源自动物的蛋白质源(包括FBS)在培养期间使用，其可能导致稳定性问题如在开发用于临床应用的干细胞物时在物种之间的污染。因此，从常规培养方法获得的干细胞的临床应用具有许多局限性。
[0007] 作为一种克服使用源自动物的蛋白质源(即FBS)的问题的方法，可使用一种利用基础培养基的方法和一种使用包含人血清的培养基的方法。使用基础培养基的方法包括在含大量细胞因子如生长激素的培养基中培养干细胞，如此该方法是麻烦且不经济的。还有，使用包含人血清的培养基的方法还包括使用通过重组方法制备的大量细胞因子和使用昂贵的人血清作为蛋白质源来进行培养，如此该方法是经济上低效的。
[0008] 同时，干细胞可分类为成人干细胞(见于成人的各种组织和器官中)和胚胎干细胞(可从囊胚阶段(blastodermic stage)的细胞获得)。胚胎干细胞具有分化成各种细胞如神经细胞、血液细胞和胰腺细胞的全能性(pluripotency)；然而，胚胎干细胞自人胚胎获得，如此受制于伦理问题。因此，不存在伦理问题
的成人干细胞可容易地分离和培养，且能分化成各种细胞，如此，更多的关注将成人干细胞作为细胞产品的材料。
[0009] 可从多种组织分离成人干细胞，其为可分化成各种组织细胞如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、心细胞、肝细胞和神经细胞的未分化的干细胞。其中，源自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)是成人干细胞的一个代表性的例子。
[0010] 然而，当干细胞供体的年龄增长时，BM-MSC的数目和增殖效力降低，而且骨髓提取对供体引起很大疼痛。因此，试图从不同组织分离间充质细胞。由于最近有各种报告称间充质细胞可从成人或胚胎的外周血、脐带、胎盘和脐带血分离，因此从各种组织获得的间充质细胞作为新的细胞产品的来源受到大量关注。
[0011] 脐带包含血管和血管周围的结缔组织(称为Wharton's jelly)。在妊娠期间，脐带的长度可以为约30cm至60cm，脐带的重量可以为约40g至约50g。而且，脐带包含用于供应给胎儿的充足量的营养物、干细胞和前体细胞。最近，已报告源自脐带的细胞具有BM-MSC 特性。类似于骨髓和其他组织来源的间充质干细胞，脐带来源的干细胞表达细胞表面蛋白质如CD73、CD90、CD105、CD10、CD13、CD29、CD44和HLA-ABC，但不表达细胞表面蛋白质如CD34和CD45(其为造血干细胞标志物)以及CD14、CD31、CD33和HLA-DRα(其为组织相容性抗原)。此外，已报告从脐带分离的干细胞同时表达Oct4、Sox2、Nanog等胚胎干细胞标志物。
[0012] 脐带来源的干细胞可分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，且比骨髓或脂肪来源的细胞在体外培养期间具有更好的有丝分裂活性。还报告脐带来源的干细胞可分化成心肌细胞和神经细胞。在这一方面，脐带是一种可供应干细胞用于临床应用的组织，且可用作细胞产品。
[0013] 然而，需要极大量的脐带来源的干细胞以有效使用脐带来源的干细胞。然而，可从脐带获得的干细胞数是有限的，而且许多干细胞在培养期间失去分化效力。然而，目前尚无已知的在基础培养基中有效分离和培养脐带来源的干细胞的方法。在研究解决该问题的各种办法时，发现当使用脐带来源的提取物时可有效分离并培养脐带来源的干细胞，如此完成本发明。
[0014] 发明概述
[0015] 本发明的一个或多个实施方案包括一种制备脐带提取物的方法。
[0016] 本发明的一个或多个实施方案包括一种血清替代物，其包含所述脐带提取物。[0017] 本发明的一个或多个实施方案包括一种细胞培养基，其包含所述血清替代物。[0018] 本发明的一个或多个实施方案包括一种从脐带分离脐带来源的干细胞(包含脐带提取物)的方法，和一种培养脐带来源的干细胞的方法。
[0019] 其他方面将部分在以下说明中列出，部分根据说明书将是明显的，或者可通过实践所呈现的实施方案学到。
[0020] 附图简述
[0021] 这些和/或其他方面根据以下对实施方案的描述，连同所附附图将变得明显和更容易领会的：
[0022] 图1是显示在不同搅动时间洗脱的蛋白质总量的图；
[0023] 图2是显示当改变培养基时和不改变培养基时在不同时间洗脱的蛋白质总量之间的比较的图；
[0024] 图3和4显示不同脐带大小时洗脱的蛋白质总量；
[0025] 图5和6是显示在不同的缓冲液pH下洗脱的蛋白质总量和用于鉴定洗脱蛋白质之间差异的SDS-PAGE结果的图；
[0026] 图7和8是显示根据洗脱方法洗脱的蛋白质总量的图；
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