(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510184621.4
(22)申请日 2015.04.17
(71)申请人 张以恒
地址 美国弗吉尼亚州布莱克斯堡镇爱丽丝
路3107
申请人 游淳
(72)发明人 张以恒 游淳
(74)专利代理机构 北京思元知识产权代理事务
所(普通合伙) 11598
代理人 余光军
(51)Int.Cl.
C12P 7/02(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种肌醇的制备方法，属于肌
醇的酶催化制备领域。本发明所公开的肌醇的制
在一个多酶反应体系中，通过体外多酶高效催化
将底物转化为肌醇；本发明通过过程优化，添加
升了原料的转化效率和肌醇的产率。本发明方法
原料转化率高，肌醇产率高，步骤简捷，生产成本
低，对环境影响小，
可实现肌醇的规模化生产。权利要求书1页 说明书9页 附图6页CN 106148425 A 2016.11.23
C N 106148425
A
1.一种肌醇的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以淀粉或淀粉衍生物为底物，加入葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶建立多酶反应体系，进行酶催化反应；(2)将反应产物进行分离、纯化，即得。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述多酶反应体系中还含有淀粉去分支酶，麦芽糖磷酸化酶和α淀粉酶，或者，淀粉去分支酶，葡聚糖转移酶和α淀粉酶；所述淀粉去分支酶为异淀粉酶或普鲁兰酶中的任意一种或两种。
3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述多酶反应体系中还含有聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述淀粉衍生物包括部分水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖中的任意一种或多种。
5.一种肌醇的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以纤维素或纤维素衍生物为底物，加入纤维素酶，纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶建立多酶反应体系，进行酶催化反应；(2)将反应产物分离、纯化，即得。
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)优选为，先将纤维素或纤维素衍生物和纤维素
酶混合，然后离心，去上清，得到纤维素酶和纤维素的混合物；所述纤维素酶和纤维素的混合物中的纤维素酶不含葡萄糖苷酶；
在纤维素酶和纤维素的混合物中，加入纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶，建立多酶反应体系。
7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述多酶反应体系中还含有聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。
8.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述纤维素衍生物包括纤维素经过预处理后的产物，纤维多糖或纤维二糖中的任意一种。
9.按照权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于，所述多酶反应体系还含有以下成分：缓冲液、无机磷酸根、二价镁离子，锌离子或锰离子。
肌醇的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及肌醇的制备方法，尤其涉及体外多酶催化将淀粉或纤维素以及它们的衍生物转化为肌醇的方法，属于肌醇的酶催化生产领域。
背景技术
[0002] 肌醇又名环已六醇，是水溶性维生素B族中的一种。肌醇是人、动物与微生物生长的必需物质，广泛应用于医药、食品、饲料等行业。目前全球的需求量大概在每年5,000吨左右，由于目前肌醇的高售价，使得肌醇的市场前景还未得到充分的开发，例如2013年全球饲料产量为9.6亿吨，如果都加入0.2-0.5％的肌醇，那么饲料工业所需肌醇的产量应该达到每年190-480万吨。在这种情况下，目前中国国内，甚至全世界的产量都远远不能满足需求。
[0003] 目前肌醇的生产主要还是传统的高温加压水解植酸(六磷酸肌醇)。该工艺设备材质要求严格，一次性投资大，操作压力只能控制在一定的范围内，限制了原材料利用率的提高，且粗产品精制工艺复杂，损失较多，生产成本较高，而且该工艺会产生大量的磷酸污染物，对水源，环境污染严重。近些年，为了减少能耗和污染开发了常压水解法。目前研究肌醇生产的热点在化学合成法和微生物酶解法，然而均不同程度的存在成本高、产率低等问题。
[0004] 因此，亟待开发一种低成本，低污染，高产率的生产肌醇的新方法。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种肌醇的酶催化转化方法，通过体外多酶催化淀粉或纤维素
以及它们的衍生物和葡萄糖生产肌醇的方法，该方法具有肌醇产率和转化率高，生产成本低，无污染等优点。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0007] 本发明首先公开了一种肌醇的制备方法，包括以下步骤：
[0008] (1)以淀粉或淀粉衍生物为底物，加入葡聚糖磷酸化酶(α-Glucan phosphorylase，EC 2.4.1.1)，葡萄糖磷酸变位酶(Phosphoglucomutase，EC 5.4.2.2)，肌醇-3-磷酸合成酶(Inositol-3-phophate synthase，EC 5.5.1.4)和肌醇单磷酸酶(Inositol monophosphatase，EC 3.1.3.25)建立多酶反应体系，进行酶催化反应；(2)将反应产物进行分离、纯化，即得。
[0009] 其中，步骤(1)所述底物的浓度为10g/L；所述葡聚糖磷酸化酶的用量为0.05U/ mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为1U/mL，所述肌醇-3-磷酸合成酶的用量为0.05U/mL，所述肌醇单磷酸酶的用量为2U/mL；所述酶催化反应的条件是在40-80℃反应10-100小时；优选为，在60℃反应40小时。
[0010] 在所述多酶反应体系中加入淀粉去分支酶和麦芽糖磷酸化酶(EC2.4.1.8)，或者，淀粉去分支酶和葡聚糖转移酶(EC 2.4.1.25)，能够有效提高肌醇的得率和转化率；优选
的，所述淀粉去分支酶的用量为1U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶(maltose phosphorylase，EC 2.4.1.8)或
葡聚糖转移酶的用量为1U/mL；其中，所述去分支酶为异淀粉酶(isoamylase，EC3.2.1.68)或普鲁兰酶(pullulanase，EC 3.2.1.41)中的任意一种或两种；
[0011] 更优选的，所述底物的浓度为10g/L；所述葡聚糖磷酸化酶的用量为5U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为1U/mL，所述肌醇-3-磷酸合成酶的用量为5U/mL，所述肌醇单磷酸酶的用量为2U/mL，所述淀粉去分支酶的用量为1U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶或葡聚糖转移酶的用量为1U/mL；
[0012] 所述酶催化反应在40-100℃反应10-100小时；优选的，所述酶催化反应在40-80℃反应40小时；最优选的，所述酶催化反应在80℃反应40小时。
[0013] 为了进一步提高肌醇的得率，将冗余的葡萄糖转化为肌醇，在所述多酶反应体系中加入聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphate glucokinase，EC2.7.1.63)和聚磷酸盐；优选的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为1U/mL，所述聚磷酸盐的用量为10mM；其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。
[0014] 所述多酶反应体系还含有以下各成分：缓冲液、无机磷酸根、二价镁离子和锌离子或锰离子；优选的，各成分的用量为：缓冲液100mM，无机磷酸根10mM，二价镁离子5mM，锌离子或锰离子0.5mM；其中，所述缓冲液优选为HEPES缓冲液，更优选的，HEPES缓冲液的pH值7.2。
[0015] 反应结束后，残余的淀粉残渣将是纯的直链淀粉，此时可加入少量的α淀粉酶(EC 3.2.1.1)促进淀粉残渣的水解，进一步提高肌醇的产量。优选的，α淀粉酶的用量为0.1U/ml。
[0016] 本发明以淀粉或淀粉衍生物为底物，加入葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶，配制多酶反应体系，多酶催化途径包括：由葡聚糖磷酸化酶将淀粉或淀粉衍生物中的一个葡萄糖单元转化为葡萄糖-1-磷酸；由葡萄糖磷酸变位酶将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸；由肌醇-3-磷酸合成酶将葡萄糖-6-磷酸转化为肌醇-3-磷酸，由肌醇单磷酸酶将肌醇-3-磷酸转化为肌醇。由于由肌醇-3-磷酸合成酶将葡萄糖-6-磷酸转化为肌醇-3-磷酸和由肌醇单磷酸酶将肌醇-3-磷酸转化为肌醇的两个酶催化反应是不可逆反应，所以该酶催化体系能够得到很高的转化率。而高得率和高转化率可以大大降低最终肌醇的分离成本。
[0017] 由于淀粉是直链淀粉(20-30％)和支链淀粉(70-80％)的混合物。支链淀粉中的支链是以α-1,6糖苷键与主链相连的，而葡聚糖磷酸化酶并不能分解α-1,6糖苷键。为了提高肌醇的转化率，本发明在多酶反应体系中加入了能够分解淀粉中α-1,6糖苷键的去分支酶—异淀粉酶或普鲁兰酶。由于葡聚糖磷酸化酶水解淀粉的最终产物是麦芽糖，为了利用麦芽糖，本发明还在反应体系中加入麦芽糖磷酸化酶，将麦芽糖分解为葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖；更优选的，本发明在多酶反应体系中再加入聚磷酸和聚磷酸葡萄糖激酶，将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，由肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶转化为肌醇，最终将淀粉及其衍生物中所有的葡萄糖单元转化为肌醇，从而提高肌醇的得率和转化率。在这里，麦芽糖磷酸化酶可被葡聚糖转移酶(4-a-glucanotransferase，EC.2.4.1.25)替换，该酶可以将短链的寡聚糖聚合成为长链的寡聚糖，而该长链的寡聚糖又可被葡聚糖磷酸化酶重新利用，从而能够提高淀粉的利用率。
[0018] 本发明所述淀粉优选为可溶性淀粉；所述淀粉衍生物包括部分水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖中的任意一种或多种。
[0019] 本发明还公开了另一种肌醇的制备方法，包括以下步骤：
[0020] (1)以纤维素或纤维素衍生物为底物，加入纤维素酶，纤维多糖磷酸化酶(cellodextrin phosphorylase，EC 2.4.1.49)、纤维二糖磷酸化酶(cellobiose phosphorylase，EC 2.4.1.20)、葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)、肌醇-3-磷酸合成酶(EC 5.5.1.4)和肌醇单磷酸酶(EC 3.1.3.25)建立多酶反应体系，进行酶催化反应；(2)将反应产物分离、纯化，即得。
[0021] 本发明以纤维素为底物，加入纤维素酶，纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶，配制多酶反应体系，该多酶催化途径包括：由纤维素酶水解纤维素生成纤维多糖和纤维二糖；由纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶将纤维多糖或纤维二糖的一个葡萄糖单元转化为葡萄糖-1-磷酸；由葡萄糖磷酸变位酶将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸；由肌醇-3-磷酸合成酶将葡萄糖-6-磷酸转化为肌醇-3-磷酸，由肌醇单磷酸酶将肌醇-3-磷酸转化为肌醇。
[0022] 其中，步骤(1)优选为，先将10g/L纤维素或纤维素衍生物和5U/ml纤维素酶在冰水浴上混合，放置于冰水浴中5分钟，然后4o C离心，去上清，得到纤维素酶和纤维素的混合物；该处理能够去除商业化纤维素酶中几乎所有的葡萄糖苷酶，这样可以避免葡萄糖苷酶水解纤维二糖生成大量的葡萄糖，从而使
主要的水解产物是纤维二糖和纤维多糖。[0023] 在多酶反应体系中，所述纤维素酶和纤维素的混合物的浓度为10g/L；所述纤维多糖磷酸化酶的用量为5U/mL，所述纤维二糖磷酸化酶的用量为5U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为1U/mL，所述肌醇-3-磷酸合成酶的用量为5U/mL，所述肌醇单磷酸酶的用量为2U/mL；所述酶催化反应是在20-100℃反应10-100小时；优选为，在40-80℃反应72小时；最优选为，在50℃反应72小时。
[0024] 为了进一步提高肌醇的得率，步骤(1)中的多酶反应体系加入聚磷酸葡萄糖激酶(EC 2.7.1.63)和聚磷酸盐；优选的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为5U/mL，所述聚磷酸盐的用量为10mM；其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。
[0025] 为了提高酶催化反应的效率和产品的收率，所述多酶反应体系还含有以下各成分：缓冲液、无机磷酸根、二价镁离子和锌离子或锰离子；优选的，各成分的用量为：缓冲液100mM，无机磷酸根10mM，二价镁离子5mM，锌离子或锰离子0.5mM；其中，所述缓冲液优选为100mM HEPES缓冲液；进一步优选的，所述HEPES缓冲液的pH值是7.2。
[0026] 本发明在多酶反应体系中再加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸，将纤维素水解后的最终产物葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，再由肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶催化转化为肌醇，最终将纤维素及其衍生物中所有的葡萄糖单元转化为肌醇。
[0027] 本发明所述纤维素衍生物包括纤维素经过预处理后的产物，纤维多糖或纤维二糖中的任意一种；
[0028] 其中，纤维素预处理方法有多种，例如酸水解法、酶水解法、物理法等；本发明所述纤维素经过预处理后的产物，优选为纤维素经过浓磷酸处理后的产物。
[0029] 本发明多酶反应体系中的任何一种酶还可以为任何一种具有同等功能的酶所替换，优选为通过蛋白质工程改造所获得的具有同等功能的突变酶。
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