(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011220071.4
(22)申请日 2020.11.05
(71)申请人 南京康齐生物科技有限公司
地址 211300 江苏省南京市高淳区经济开
发区花山路17号
(72)发明人 谈满良 李小冬 易武
(74)专利代理机构 苏州吴韵知识产权代理事务
所(普通合伙) 32364
代理人 王铭陆
(51)Int.Cl.
C12P 7/64(2006.01)
C12N 11/089(2020.01)
C12N 9/20(2006.01)
C07C 51/47(2006.01)
C07C 57/03(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了蒜头果油中高纯度神经酸的
定化脂肪酶；在锥形瓶中加入蒜头果油，加入磷
酸缓冲溶液和蒜头果油的吐温‑80，在恒温磁力
搅拌器上室温乳化；放入恒温磁力搅拌器，在40
℃的恒温水浴上加入为固定化脂肪酶，磁力搅拌
水解；分离油脂层，80℃水洗多次至溶液中性，冷
却后得到混合脂肪酸的固体，干燥得到神经酸粗
品；以乙酸乙酯和乙醇的混合物溶解神经酸粗
品；加入活性炭搅拌，加热回流；过滤，浓缩至神
经酸粗品质量的2倍，调节pH，结晶；过滤干燥得
高纯度神经酸。本发明中采用的方法与设备都很
简单，
提取的神经酸纯度高达95%以上。权利要求书1页 说明书4页CN 112391420 A 2021.02.23
C N 112391420
A
1.蒜头果油中高纯度神经酸的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取粗脂肪酶液2g，加入PEG2000溶液和(NH 4)2SO 4，加水至总重量为10g进行分离萃取；
（2）在转速为3000r/min下离心5min，分相，获得高活性脂肪酶；
（3）取1g干硅胶加入20mL丙酮中与10%的3-APTES混匀，50℃下磁力搅拌2h，抽滤，用去离子水冲洗3-5次，放入60℃烘箱中，干燥2h；
（4）往以上烘干的硅胶中加入lmmol/L、pH为7.0的磷酸缓冲液20mL，然后加入25％的戊二醛2mL，20℃活化2h，将活化的硅胶抽滤，用去离子水洗，60℃下烘2h；
（5）将活化的硅胶加到20mL高活性脂肪酶溶液中，在20℃下固定，用去离子水洗、抽滤、室温过夜风干得固定化脂肪酶；
（6）在锥形瓶中加入5ml蒜头果油，加入10ml pH为7的磷酸缓冲溶液和2 %蒜头果油的吐温-80，在恒温磁力搅拌器上室温乳化10min；
（7）放入恒温磁力搅拌器，在40℃的恒温水浴上加入为15-20g固定化脂肪酶，磁力搅拌水解24-48 h；
（8）分离油脂层，80℃水洗多次至溶液中性，冷却后得到混合脂肪酸的固体，干燥得到神经酸粗品；
（9）以乙酸乙酯和乙醇的混合物溶解神经酸粗品；
（10）加入0.5-5wt%活性炭搅拌，加热回流1-3h；
（11）过滤，浓缩至神经酸粗品质量的2倍，调节pH至4-5，0-4℃结晶8-10h；
（12）过滤，35-50℃下干燥2-7h即得高纯度神经酸。
2.根据权利要求1所述的蒜头果油中高纯度神经酸的提取方法，其特征在于，所述步骤
（1）中粗脂肪酶液的来源为动物或微生物。
3.根据权利要求2所述的蒜头果油中高纯度神经酸的提取方法，其特征在于，所述微生物为洋葱伯克霍尔德菌或铜绿假单胞菌。
4.根据权利要求1所述的蒜头果油中高纯度神经酸的提取方法，其特征在于，所述步骤
（1）中PEG2000的浓度为25%，(NH 4)2SO 4的浓度为12%。
5.根据权利要求1所述的蒜头果油中高纯度神经酸的提取方法，其特征在于，所述步骤
（1）中分离萃取条件为在温度为40℃下萃取1h。
6.根据权利要求1所述的蒜头果油中高纯度神经酸的提取方法，其特征在于，所述步骤
（9）中乙酸乙酯和乙醇的体积比为2:1。
权 利 要 求 书1/1页CN 112391420 A
蒜头果油中高纯度神经酸的提取方法
技术领域
[0001]本发明涉及提取物制备领域，具体涉及蒜头果油中高纯度神经酸的提取方法。
背景技术
[0002]蒜头果是铁青树科，主要分布于云南东南部文山州的广南、富宁和广西西部与云南接壤的局部地区，为我国特有的单种属孑遗树种，因分布范围与种数量十分有限，2010年被国家列为云南省20个极小种之一。
[0003]蒜头果种子含有丰富的油脂，含量高达50％-55％。其中，在蒜头果油中二十四碳15-烯酸，（也称为神经酸）所占脂肪酸比例高达40％-50％。神经酸是一种不饱和脂肪酸，对人体的益处很多，它可以使神经末稍活性恢复甚至增强，促机体进神经细胞组织的生长和发育，并对患有心脑血管疾病和人体自身免疫缺乏性疾病的患者有很好的疗效。
[0004]目前，一般提取纯化方法为采用谱柱层析法，但是此方法对实验仪器等要求较高，因此，如何提供一种更加简单有效的提取纯化方法是本领域技术人员亟需解决的问题。[0005]
发明内容
[0006]要解决的技术问题：本发明的目的是提供一种蒜头果油中高纯度神经酸的提取方法，采用的方法与设备都很简单，提取的神经酸纯度高达95%以上。
[0007]技术方案：蒜头果油中高纯度神经酸的提取方法，包括以下步骤：（1）取粗脂肪酶液2g，加入PEG2000溶液和(NH4)2SO4，加水至总重量为10g进行分离萃取；
（2）在转速为3000r/min下离心5min，分相，获得高活性脂肪酶；
（3）取1g干硅胶加入20mL丙酮中与10%的3-APTES混匀，50℃下磁力搅拌2h，抽滤，用去离子水冲洗3-5次，放入60℃烘箱中，干燥2h；
（4）往以上烘干的硅胶中加入lmmol/L、pH为7.0的磷酸缓冲液20mL，然后加入25％的戊二醛2mL，20℃活化2h，将活化的硅胶抽滤，用去离子水洗，60℃下烘2h；
（5）将活化的硅胶加到20mL高活性脂肪酶溶液中，在20℃下固定，用去离子水洗、抽滤、室温过夜风干得固定化脂肪酶；
（6）在锥形瓶中加入5ml蒜头果油，加入10ml pH为7的磷酸缓冲溶液和2 %蒜头果油的吐温-80，在恒温磁力搅拌器上室温乳化10min；
（7）放入恒温磁力搅拌器，在40℃的恒温水浴上加入为15-20g固定化脂肪酶，磁力搅拌水解24-48 h；
（8）分离油脂层，80℃水洗多次至溶液中性，冷却后得到混合脂肪酸的固体，干燥得到神经酸粗品；
（9）以乙酸乙酯和乙醇的混合物溶解神经酸粗品；
（10）加入0.5-5wt%活性炭搅拌，加热回流1-3h；
（11）过滤，浓缩至神经酸粗品质量的2倍，调节pH至4-5，0-4℃结晶8-10h；
（12）过滤，35-50℃下干燥2-7h即得高纯度神经酸。
[0008]进一步的，所述步骤（1）中粗脂肪酶液的来源为动物或微生物。
[0009]进一步的，所述微生物为洋葱伯克霍尔德菌或铜绿假单胞菌。
[0010]进一步的，所述步骤（1）中PEG2000的浓度为25%，(NH4)2SO4的浓度为12%。[0011]进一步的，所述步骤（1）中分离萃取条件为在温度为40℃下萃取1h。
[0012]进一步的，所述步骤（9）中乙酸乙酯和乙醇的体积比为2:1。
[0013]有益效果：
1、本发明采用固定化脂肪酶，一方面能够保持脂肪酶的高活性和稳定性，另一方面使其易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。
[0014]2、本发明中采用的方法与设备都很简单，提取的神经酸纯度高达95%以上。[0015]
具体实施方式
[0016]实施例1
蒜头果油中高纯度神经酸的提取方法，包括以下步骤：
（1）取粗脂肪酶液2g，加入PEG2000溶液和(NH4)2SO4，加水至总重量为10g，在40℃下进行分离萃取1h，其中，PEG2000的浓度为25%，(NH4)2SO4的浓度为12%，所述粗脂肪酶液来源于猪肉；
（2）在转速为3000r/min下离心5min，分相，获得高活性脂肪酶；
（3）取1g干硅胶加入20mL丙酮中与10%的3-APTES混匀，50℃下磁力搅拌2h，抽滤，用去离子水冲洗3次，放入60℃烘箱中，干燥2h；
（4）往以上烘干的硅胶中加入lmmol/L、pH为7.0的磷酸缓冲液20mL，然后加入25％的戊二醛2mL，20℃活化2h，将活化的硅胶抽滤，用去离子水洗，60℃下烘2h；
（5）将活化的硅胶加到20mL高活性脂肪酶溶液中，在20℃下固定，用去离子水洗、抽滤、室温过夜风干得固定化脂肪酶；
（6）在锥形瓶中加入5ml蒜头果油，加入10ml pH为7的磷酸缓冲溶液和2 %蒜头果油的吐温-80，在恒温磁力搅拌器上室温乳化10min；
（7）放入恒温磁力搅拌器，在40℃的恒温水浴上加入为15g固定化脂肪酶，磁力搅拌水解24 h；
（8）分离油脂层，80℃水洗多次至溶液中性，冷却后得到混合脂肪酸的固体，干燥得到神经酸粗品；
（9）以乙酸乙酯和乙醇的混合物溶解神经酸粗品，其中，乙酸乙酯和乙醇的体积比为2: 1；
（10）加入0.5-5wt%活性炭搅拌，加热回流1h；
（11）过滤，浓缩至神经酸粗品质量的2倍，调节pH至4，0℃结晶8h；
（12）过滤，35℃下干燥2h即得高纯度神经酸。
[0017]测定神经酸的纯度，经测定，本实施例所制备的高纯度神经酸纯度为95.6%。[0018]实施例2
蒜头果油中高纯度神经酸的提取方法，包括以下步骤：
（1）取粗脂肪酶液2g，加入PEG2000溶液和(NH4)2SO4，加水至总重量为10g，在40℃下进行分离萃取1h，其中，PEG2000的浓度为25%，(NH4)2SO4的浓度为12%，所述粗脂肪酶液来源于洋葱伯克霍尔德菌；
（2）在转速为3000r/min下离心5min，分相，获得高活性脂肪酶；
（3）取1g干硅胶加入20mL丙酮中与10%的3-APTES混匀，50℃下磁力搅拌2h，抽滤，用去离子水冲洗4次，放入60℃烘箱中，干燥2h；
（4）往以上烘干的硅胶中加入lmmol/L、pH为7.0的磷酸缓冲液20mL，然后加入25％的戊二醛2mL，20℃活化2h，将活化的硅胶抽滤，用去离子水洗，60℃下烘2h；
（5）将活化的硅胶加到20mL高活性脂肪酶溶液中，在20℃下固定，用去离子水洗、抽滤、室温过夜风干得固定化脂肪酶；
（6）在锥形瓶中加入5ml蒜头果油，加入10ml pH为7的磷酸缓冲溶液和2 %蒜头果油的吐温-80，在恒温磁力搅拌器上室温乳化10min；
（7）放入恒温磁力搅拌器，在40℃的恒温水浴上加入为18g固定化脂肪酶，磁力搅拌水解36 h；
（8）分离油脂层，80℃水洗多次至溶液中性，冷却后得到混合脂肪酸的固体，干燥得到神经酸粗品；
（9）以乙酸乙酯和乙醇的混合物溶解神经酸粗品，其中，乙酸乙酯和乙醇的体积比为2: 1；
（10）加入3wt%活性炭搅拌，加热回流2h；
（11）过滤，浓缩至神经酸粗品质量的2倍，调节pH至4.5，2℃结晶9h；
（12）过滤，38℃下干燥5h即得高纯度神经酸。
[0019]测定神经酸的纯度，经测定，本实施例所制备的高纯度神经酸纯度为97.2%。[0020]实施例3
蒜头果油中高纯度神经酸的提取方法，包括以下步骤：
（1）取粗脂肪酶液2g，加入PEG2000溶液和(NH4)2SO4，加水至总重量为10g，在40℃下进行分离萃取1h，其中，PEG2000的浓度为25%，(NH4)2SO4的浓度为12%，所述粗脂肪酶液来源于铜绿假单胞菌；
（2）在转速为3000r/min下离心5min，分相，获得高活性脂肪酶；
（3）取1g干硅胶加入20mL丙酮中与10%的3-APTES混匀，50℃下磁力搅拌2h，抽滤，用去离子水冲洗5次，放入60℃烘箱中，干燥2h；
（4）往以上烘干的硅胶中加入lmmol/L、pH为7.0的磷酸缓冲液20mL，然后加入25％的戊二醛2mL，20℃活化2h，将活化的硅胶抽滤，用去离子水洗，60℃下烘2h；
（5）将活化的硅胶加到20mL高活性脂肪酶溶液中，在20℃下固定，用去离子水洗、抽滤、室温过夜风干得固定化脂肪酶；
（6）在锥形瓶中加入5ml蒜头果油，加入10ml pH为7的磷酸缓冲溶液和2 %蒜头果油的吐温-80，在恒温磁力搅拌器上室温乳化10min；
（7）放入恒温磁力搅拌器，在40℃的恒温水浴上加入为20g固定化脂肪酶，磁力搅拌水解48 h；
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