(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010720531.3
(22)申请日 2020.07.24
(71)申请人 苏州世诺生物技术有限公司
地址 215000 江苏省苏州市吴中区苏州工
业园区若水路388号D座506室
(72)发明人 曹文龙 孔迪 滕小锘
(74)专利代理机构 南京利丰知识产权代理事务
所(特殊普通合伙) 32256
代理人 王锋
(51)Int.Cl.
A61K 39/12(2006.01)
A61P 31/20(2006.01)
C07K 19/00(2006.01)
C12N 15/62(2006.01)
C12N 15/866(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种鸡传染性贫血病毒基因
工程疫苗，其包含编码基因序列如SEQ ID NO:1
功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原
性强，对鸡等禽类没有致病性，能够在禽类体内
产生较强的体液免疫，免疫后的禽类能够抵御强
毒攻毒，并且该疫苗可以通过生物反应器大规模
无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成
本。权利要求书1页 说明书17页序列表7页 附图4页CN 111729078 A 2020.10.02
C N 111729078
A
1.一种融合蛋白，其序列如SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述融合蛋白的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
4.包含权利要求2所述编码基因的重组病毒载体或宿主细胞。
5.一种免疫组合物，其特征在于包括：权利要求1所述的融合蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。
6.如权利要求5所述的免疫组合物，其特征在于：所述医药学上可接受的载剂包括白油、硬脂酸铝、司本、吐温中的任意一种或者两种以上的组合。
7.一种融合蛋白的制备方法，其特征在于包括：
构建重组杆状病毒表达载体，所述重组杆状病毒表达载体包含权利要求2或3所述的融合蛋白的编码基因；
将所述重组杆状病毒表达载体导入昆虫细胞中，并在允许蛋白质表达的条件下培养所述昆虫细胞，之后从所述昆虫细胞的细胞培养物中分离和回收融合蛋白。
8.权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于包括：
将所述融合蛋白的编码基因克隆到杆状病毒表达系统转移载体上，获得重组穿梭载体；
将所述重组穿梭载体转化感受态细胞，获得重组杆状病毒载体；
以所述重组杆状病毒载体转染昆虫细胞并进行培养，之后从所述昆虫细胞的细胞培养物中分离和回收所述融合蛋白。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述杆状病毒表达系统转移载体包括pFastBac 1、pVL1393、pFastBac dual中的任意一种。
10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述昆虫细胞包括Sf9、High Five或 Sf21 细胞。
11.如权利要求1所述融合蛋白或权利要求5或6所述免疫组合物在制备鸡传染性贫血病毒的检测试剂，在生产用于在受试动物中诱导针对鸡传染性贫血病毒抗原的免疫反应的药剂，或者，在生产用于预防动物受鸡传染性贫血病毒感染的药剂中的用途。
12.如权利要求1所述融合蛋白或权利要求5或6所述免疫组合物在制备鸡传染性贫血病毒基因工程疫苗中的用途。
权 利 要 求 书1/1页CN 111729078 A
鸡传染性贫血病毒基因工程疫苗
技术领域
[0001]本发明涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种鸡传染性贫血病毒基因工程疫苗，其制备方法与应用，属于动物免疫药物技术领域。
背景技术
[0002]鸡传染性贫血病（Chicken Infectious Anemia，CIA）是一种由鸡传染性贫血病毒（Chicken Infectious Anemia Virus，CIAV）引起的一种免疫抑制性传染病。鸡是CIA的主要自然宿主，所有年龄的鸡都易被感染，其中鸡胚和14日龄以内的雏鸡易感性最强，发病率最高。CIAV感染后特征性病变是贫血、可视粘膜苍白，患鸡临床症状主要表现为精神沉郁、消瘦、喙肛、局部皮肤呈蓝紫、凝血时间延长等，病理变化主要表现为全骨髓萎缩、出现再生障碍性贫血和全身淋巴组织萎缩等。患鸡发病后5～6天大量死亡，发病率一般在20～60％，高时可达100％，死亡率一般在5～10％，严重时可达60％以上。CIAV可通过垂直或水平的传播方式在鸡中传播，引起免疫抑制，易导致鸡对其他病毒、细菌和真菌易感，以及继发感染；亦可干扰其他禽病疫苗的免疫效应，导致免疫失败。自Yuasa等于1979年首次报道该病毒后，该病在德国、法国等多国陆续有报道，我国于1992年由崔现兰等首次分离到该病毒。目前，CIA在国内蔓延并呈流行趋势，对养禽业造成重大的经济损失。
[0003]CIAV属于圆环病毒科环形病毒属，是单链圆环状的DNA病毒，电镜下观察呈球形或六角形，表面没有囊膜，整个病毒呈正20面体对称，平均粒径24-26 nm。CIAV基因组序列全长为2298或2319bp，这与基因组上是否存在4或5个21bp的重复序列有关。其基因组主要存在三个开放阅读框（ORFs），一个启动子区和一个多聚腺苷的信号区。三个ORFs分别编码Cap 基因编码衣壳蛋白VPl、磷酸酯酶蛋白VP2和凋亡素VP3蛋白（Meehan B M, Todd D, Creelan J L, et al. Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anaemia agent: sequence analysis of the cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genome fragments [J]. Archives of Virology, 1992,124(3-4):301-319.)。VP1蛋白是CIAV的主要衣壳蛋白和免疫蛋白，VP1蛋白富含精氨酸，与基因组DNA紧密结合，对DNA有保护功能，可刺激机体产生抗体。VP2蛋白属于非结构蛋白，是一种辅助性蛋白，其主要功能是辅助病毒装配为成熟的病毒粒子。在杆状病毒表达系统中，VP1和VP2同时合成，可以诱导机体产生针对CIAV的中和抗体，起到保护性免疫应答作用，而将单独表达的产物进行简单的混合并不能刺激机体产生中和抗体(Yamaguchi S. Identification of a genetic determinant of pathogenicity in chicken anaemia virus [J]. Journal of General Virology, 2001,82(5):1233-1238.)。VP3蛋白通常被称为调亡素，在病毒的生活周期中扮演重要角，VP3单独作用即可引起细胞凋亡。
[0004]已有一些文献报道了CIAV基因工程疫苗。例如CN110028558A提供了一种利用截短的CIAV的VP1和VP2蛋白共表达制备亚单位疫苗的方法，由于VP1的N端有大量的R，带有大量正电荷，导致VP1本身容易被碱性蛋白酶降解，使得VP1表达量低，而截短的VP1全部去掉了N
端富含R的部分则不能组装成VLP，即使与VP2共表达，VP1蛋白的表达量和组装效率依旧低。又如，CN109136198A提供了一种制备表达CIAV VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗的方法，但与杆状病毒相比，痘病毒载体安全性低，且痘病毒载体疫苗的反复接种可能产生抗载体免疫，导致免疫应答的减弱；灭活疫苗则由于CIAV可以引起免疫抑制导致免疫效果不理想；弱毒活疫苗有残存毒力，并且有毒力反强的可能性。
发明内容
[0005]本发明的主要目的在于提供一种鸡传染性贫血病毒基因工程疫苗，其制备方法与应用，以克服现有技术中的不足。
[0006]为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种融合蛋白，包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。
[0007]本发明实施例还提供了所述融合蛋白的编码基因，其包括序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子。
[0008]本发明实施例还提供了包含所述编码基因的重组病毒载体。
[0009]本发明实施例还提供了包含所述编码基因的重组杆状病毒。
[0010]本发明实施例还提供了包含所述编码基因的宿主细胞，主要为昆虫细胞。[0011]本发明实施例还提供了一种免疫组合物，其包括：所述的融合蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。
[0012]本发明实施例还提供了一种制备所述融合蛋白的方法，其包括：
构建重组杆状病毒表达载体，所述重组杆状病毒表达载体包含所述融合蛋白的编码基因；
将所述重组杆状病毒表达载体导入昆虫细胞中，并在允许蛋白质表达的条件下培养所述昆虫细胞，之后从所述昆虫细胞的细胞培养物中分离和回收融合蛋白。
[0013]本发明实施例还提供了一种制备所述融合蛋白的制备方法，其包括：将所述融合蛋白的编码基因克隆到杆状病毒表达系统转移载体上，获得重组穿梭载体；
将所述重组穿梭载体转化感受态细胞，获得重组杆状病毒载体；
以所述重组杆状病毒载体转染昆虫细胞并进行培养，之后从所述昆虫细胞的细胞培养物中分离和回收所述融合蛋白。
[0014]本发明实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在制备鸡传染性贫血病毒的检测试剂中的用途。
[0015]本发明实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在生产用于在受试动物中诱导针对鸡传染性贫血病毒抗原的免疫反应的药剂中的用途。
[0016]本发明实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在生产用于预防动物受鸡传染性贫血病毒感染的药剂中的用途。
[0017]本发明实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在制备鸡传染性贫血病毒基因工程疫苗中的用途。
[0018]相应的，本发明实施例提供了一种鸡传染性贫血病毒基因工程疫苗，其包含前述
的任一种免疫组合物。进一步的，所述疫苗还可包含医药学上可接受的载剂。
[0019]本发明实施例还提供了包含所述融合蛋白编码基因的重组病毒载体、重组杆状病毒或昆虫细胞在生产用于检测动物受鸡传染性贫血病毒感染的试剂的用途。
[0020]本发明实施例还提供了包含所述融合蛋白编码基因的重组病毒载体、重组杆状病毒或昆虫细胞在生产用于在受试动物中诱导针对鸡传染性贫血病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。
[0021]本发明实施例还提供了包含所述融合蛋白编码基因的重组病毒载体、重组杆状病毒或昆虫细胞在生产用于预防动物受鸡传染性贫血病毒感染的药剂的用途。
[0022]较之现有技术，本发明实施例通过以突变的鸡传染性贫血病毒VP1蛋白和和突变的鸡传染性贫血病毒VP2蛋白连接组装形成融合蛋白，显著提高了VP1蛋白的表达量和组装效率，安全高效，只需要很少量的抗原就能提供很好的免疫效果，利用所述融合蛋白制备的鸡传染性贫血病毒疫苗的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对鸡等禽类没有致病性，并且可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0024]图1是实施例1中Fu基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.7kbp位置出现目的条带。
[0025]图2是实施例1中菌落PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.7kbp位置出现目的条带。
[0026]图3是实施例1中含有目的基因的转移载体pF-Fu的结构示意图。
[0027]图4是实施例3所获细胞培养物的SDS-PAGE检测图谱。
[0028]图5是实施例4中SDS-PAGE电泳后产物的Western Blot检测图谱。
[0029]图6是实施例6中的间接免疫荧光检测图谱。
具体实施方式
[0030]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0031]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0032]本发明实施例的一个方面提供的一种融合蛋白包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。
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