朱丹;邹水洋
【摘 要】As a new kind of biological macromolecules,%γ-聚谷氨酸是一种新型生物高分子材料，以其强吸水性、可生物降解性、可食用性和对人类和环境无毒性等特点广泛的应用于医药、食品、农业、水处理、日用及化妆品的生产等领域。介绍了影响叫一聚谷氨酸生产的因素及其应用。
【期刊名称】《东莞理工学院学报》
【年(卷),期】2011(018)005
【总页数】5页(P44-48)
【关键词】γ-聚谷氨酸;生产;应用
【作 者】朱丹;邹水洋
【作者单位】东莞理工学院化学与环境工程学院,广东东莞523808;东莞理工学院化学与环境工程学院,广东东莞523808
【正文语种】中 文
【中图分类】TQ92
γ-聚谷氨酸 (poly-γ-glutamic acid，简称γ-PGA) 是由L-谷氨酸或D-谷氨酸通过γ-酰胺键结合形成的一种水溶性的生物高分子材料。由枯草芽孢杆菌发酵生产的γ-PGA的结构式如下［1］: 图1 γ-PGA的结构式
γ-PGA最早发现于1913年，是一些芽孢杆菌荚膜结构的主要成分，随后1937年Ivãnovics等发现了芽孢杆菌的荚膜含有γ-PGA，而自从1942年Bovamick等发现γ-PGA作为种发酵产物能自由地分泌到枯草芽孢杆菌的生长培养基中后，人们发现多种芽孢杆菌都能在胞外产生γ-PGA［2］。
其分解温度为235.8℃，熔点为223.5℃。由芽孢杆菌产生的γ-PGA的平均分子量在1×105～8×106之间，而多分散性在2～5之间。相对分子量越大，其流变性很难控制也很难被化学试剂修饰，因而限制了γ-PGA的应用。目前用水解法、降解法及生物降解法，可得到不同分子量的γ-聚谷氨酸［1］。
1 γ-PGA的生产方法
γ-PGA的生产方法有以下四种:化学合成法、提取法、酶转化法和微生物发酵合成法。前三种方法工艺较复杂，成本高，不适合实际生产应用［3-4］。利用传统菌株进行微生物发酵合成 γ-PGA是最常用的方法。自γ-PGA被发现以来，众多学者相继开展了γ-PGA高产菌株的选育、代谢途径、发酵工艺、分离提纯以及应用的研究，但迄今为止仍处于实验室阶段，小试生产方法归纳起来主要有分批发酵法、连续发酵法、液体两相发酵法、搅拌罐反应器自循环发酵法、固体发酵法和固定化酶法等，分批发酵法简单方便，易操作和控制，周期较短，因此在实验室研究中较为广泛［3］。党建宁等则研究了补料分批发酵方式对聚谷氨酸产量的影响，在较低玉米糖化液、氮源、前体物浓度条件下进行全组分补料，结果比分批发酵方式的γ-PGA产量提高了43.1%(质量分数)［5］。本课题组利用纳豆芽孢杆菌进行液态与固态发酵生产γ-PGA的系列研究，并达到了较高的生产水平 (研究结果另文发表)。
1.1 γ-PGA的主要生产菌株
γ-PGA的生产菌主要是芽孢杆菌属的菌株，包括各种 (纳豆)枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌 (B.licheniformis)、芽孢杆菌 (B.anthracis)。根据细胞生长的营养要求是否需要 L-谷氨酸，可以把γ-PGA生产菌分为两大类:一类是培养时需要 L-谷氨酸才能积累 γ-PGA;一类是培养时不需要 L-谷氨酸也能积累 γ-PGA［1，6-7］。主要菌种如表1所示。
表1 γ-PGA的主要生产菌株L-谷氨酸依赖型 L-5E B.subtilis MR-141 B.licheniformis A35 B.licheniformis ATCC 9945a B.subtilis TAM-4等Bacillus IFO3335 Bacillus subtilis F-2-01谷氨酸非依赖型B.anthracis B.subtilis等
1.2 碳源对生产γ-PGA的影响
作为微生物生长所必需的物质，碳源是微生物生长的碳架和能量来源，且能通过某种代谢途径转化成谷氨酸参与γ-PGA的合成。PGA生产菌所需的碳源约是所合成的PGA总量的2～20倍［2］。Goto和Kunioka报道枯草芽孢杆菌IFO3335生产γ-PGA时，柠檬酸是最佳的碳源。
Gross和同事们用地衣芽孢杆菌ATCC9945a生产γ-PGA，柠檬酸也作为最佳碳源。徐虹等研究枯草芽孢杆菌NX-2生产γ-PGA时添加的多种碳源，在有葡萄糖或者蔗糖存在的条件下，γ-PGA产量很高，达到约30 g/L。乳糖对NX-2生长有好处，但对于γ-PGA的产生没有作用。甘油也是一种很好的碳源。当添加了30 g/L的甘油，就能积累24.3 g/L γ-PGA。但有趣的是，NX-2不能利用柠檬酸作为碳源生产γ-PGA，推测NX-2是缺少了一些糖合成途径的酶，所以它不能在TAC循环中利用柠檬酸作为细胞生产的碳源，γ-PGA合成系统也不能形成，因此，没有γ-PGA产生［8］。张艳丽等用纳豆芽孢杆菌QY-09生产γ-PGA时也添加了不同种类的碳源，结果以葡萄糖为碳源时，γ-PGA的产量最高，且葡萄糖浓度在10～50 g/L范围内，γ-PGA的产量随葡萄糖浓度增加而增加，但是葡萄糖浓度进一步增加，产量会降低且出现多糖副产物［9］。
1.3 L-谷氨酸对生产γ-PGA的影响
γ-PGA产生菌有两种，L-谷氨酸依赖型和L-谷氨酸非依赖型，但是文献中报道的最多的仍然是以L-谷氨酸依赖型作为生产实用菌。在这些菌株中，谷氨酸的作用是不同的。对于枯草芽孢杆菌MR-141，谷氨酸作为原料合成γ-PGA，但对于IFO3335，在γ-PGA合成途径中，谷氨
酸则作为激活酶而不是原料。徐虹等研究NX-2生产γ-PGA时L-谷氨酸的作用，发现缺少谷氨酸时，没有γ-PGA产生。γ-PGA数量的增加随着培养基中添加的谷氨酸的量的增加而增加。奇怪的是γ-PGA中的谷氨酸单体和残留在发酵液中的谷氨酸的总量比添加的谷氨酸要多的多，γ-PGA的产量也超过葡萄糖转变而来的谷氨酸的总量。从这个结果可以推断在γ-PGA中的谷氨酸单体有两个来源:一是培养基中参与合成的谷氨酸，另一个来源是葡萄糖经糖酵解和三羧酸循环合成的谷氨酸［8］。
1.4 氮源对生产γ-PGA的影响
氮源能提供细胞原生质和其他结构物质中的氮素，因此合适的氮源对γ-PGA的发酵生产也具有重要作用。张艳丽等经过研究发现酵母膏为氮源时γ-PGA的产量最高，蛋白胨次之，但从经济角度考虑选定蛋白胨为氮源［9］。
1.5 pH值对生产γ-PGA的影响
pH值对细胞的生长及γ-PGA的生产都是一个重要的环境因子。经研究发现γ-PGA的产量取决于胞内谷氨酸盐的含量，而增加胞内谷氨酸盐的一个有效的途径就是增加胞外谷氨酸盐的利
用率，谷氨酸盐的转化系统对pH值也很敏感。因为整个发酵过程不能总是保持最佳pH值，并且细胞生长和培养基的利用所需的最佳pH值不同，所以吴等用枯草芽孢杆菌CGMCC 0833生产γ-PGA时，采用了两个阶段的pH值移位控制战略。在最初的24 h，pH值控制在7.0以获得最大生物量，然后pH值降为6.5以获得谷氨酸盐的高转化率和γ-PGA的高产［10］。
1.6 金属离子对生产γ-PGA的影响
金属离子是微生物正常代谢所必不可少的一类营养物质，它在维持参与γ-PGA的合成过程中的酶的活性中心构象以及保持酶的活性中有重要作用。张艳丽等研究了金属离子对纳豆芽孢杆菌QY-09生产γ-PGA的作用，发现适量的金属离子对合成γ-PGA有促进作用，且该菌株对MgSO4的浓度变化最敏感［9］。梁金钟等研究发现，Ca2+、Na+、Mg2+、K+、Mn2+等离子对枯草芽孢杆菌 B-115生产 γ-PGA合成酶系都有着极其重要的影响［11］。可见对于金属离子的添加不但要考虑对γ-PGA生产的影响，还要考虑对菌株生长的影响。同时，他们还发现适量的氨基酸、有机酸和维生素等添加物也能提高 γ-PGA的产率［12］。
1.7 发酵时间对生产γ-PGA的影响
发酵时间也是生产γ-PGA时要考虑的一个因素。因为γ-PGA是一种可生物降解的水溶性分子，以γ-PGA作为唯一碳源和氮源对可降解γ-PGA的菌株进行筛选，结果筛选出至少12株可降解 γ-PGA的菌株［13］。由此发酵过程中要把握发酵生产的时间，以免时间过长导致γ-PGA被降解。
1.8 NaCl的添加对生产γ-PGA的影响
在自然环境中，产生γ-PGA是纳豆芽孢杆菌对环境缺水的一种适应机制，环境缺水的重要信号往往是外界环境渗透压的提高。李大力等［14］在发酵液中添加浓度小于50 g/L的 NaCl时，纳豆芽孢杆菌产γ-PGA的产量有显著提高，分子量分布加大，但分子结构没有改变。
2 γ-PGA的分离提纯
通过微生物发酵得到高黏度的发酵液，γ-PGA可使用有机溶剂沉淀法、化学沉淀法和膜分离沉淀法等方法获得。
2.1 有机溶剂沉淀法和化学沉淀法
有机溶剂沉淀法是指利用离心或凝聚菌体的方法除去发酵液中的菌体，在上清液中加入低级醇类(如甲醇、乙醇)来沉淀得到 γ-PGA，经冷冻干燥得到白结晶。而化学沉淀法是用饱和的 CuSO4、NaCl溶液代替低级醇类盐析沉淀γ-PGA［3］。发酵结束后，发酵液为淡黄黏稠状液体，具有很高的黏度，给菌液分离带来一定的难度，所以需要对发酵液进行预处理，即通过将发酵液调为酸性降低其黏度，以便菌液分离。
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