(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810462322.6
(22)申请日 2018.05.15
(71)申请人 南京工业大学
地址 210000 江苏省南京市浦口区浦珠南
路30号
(72)发明人 董维亮 徐宁 信丰学 周杰
马江峰 姜岷
(74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所
(普通合伙) 32204
代理人 肖明芳
(51)Int.Cl.
C12P 19/44(2006.01)
C12R 1/385(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种鼠李糖脂的高效发酵工
艺，其发酵菌种具有良好的遗传稳定性，可满足
生产需求。经过发酵条件优化后，该菌利用30g/L
甘油、60g/L菜籽油作为复合碳源，5L发酵罐经过 192h发酵，其鼠李糖脂最高产量达到53.3g/L。与
现有技术相比，本发明在等量碳源供给的情况
下，可获得同等的鼠李糖脂产量；同时，由于工业
甘油的价格低廉，利用甘油作为底物降低了其生
产成本，从而提高了生物表面活性剂鼠李糖脂的
应用潜力。权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 108342431 A 2018.07.31
C N 108342431
A
1.一种鼠李糖脂的高效发酵工艺，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)将菌种活化后接种于培养基中，培养后得到种子液； (2)将步骤(1)中所得的种子液接种至发酵培养基中，发酵完成后，取发酵液与正己烷混合后，离心分层得到含鼠李糖脂的发酵液。
2.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(1)中，所述的菌种为铜绿假单胞菌。
3.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(1)中，所述的培养基为LB液体培养基，配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
4.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(1)中，培养条件为：在30℃，200rpm下培养22～26h。
5.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(1)中，接种时，保证菌体在OD 600的吸光度为5.0～
6.0。
6.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(2)中，发酵培养基中的发酵底物为甘油和菜籽油。
7.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(2)中，发酵培养基的配方为：甘油10～30g/L，菜籽油20～80g/L，酵母提取物3g/L，NaNO 3 6g/L，KH 2PO 4 1g/L，Na 2HPO 4 1g/L，CaCl 2·2H 2O 0.11g/L，MgSO 4 0.1g/L。
8.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(2)中，接种时，种子液体积为发酵培养基体积的5～7％。
9.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(2)中，发酵的条件为：发酵时间为168～192h；发酵液初始pH值为7.0～7.5，96～120h后控制pH值为6.5～7.0；发酵罐通气比为1.0～1.5v/v ·m，搅拌速率为200～400rpm。
10.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(2)中，发酵液和正己烷的体积比为1：1。
权 利 要 求 书1/1页CN 108342431 A
一种鼠李糖脂的高效发酵工艺
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鼠李糖脂的高效发酵工艺。
背景技术
[0002]生物表面活性剂来源于微生物和动植物，由亲水基(酸、阳离子、阴离子、单糖、双糖或多糖)和疏水基(饱和、不饱和烃链或脂肪酸)构成。与化学合成表面活性剂相化较，生物表面活性剂化学结构更复杂，功能基团多，具有降低液体表面/界面张力、形成胶束以及两相微乳液等多种表面活性功能，同时具有良好的热稳定性和化学稳定性，且产品本身无毒，环境友好，可被环境微生物降解，具有较好的生物相容性，是典型的环保型＂绿产品＂。此外，近年研究表明，生物表面活性剂可干扰细胞膜通透性，具有一定的抗菌、抗肿瘤、抗病毒等药理作用和免疫功能，可被开发成新型生物医药和生物农药，对于缓解农药环境污染等问题具有突出作用。因此，出于环境和人类健康角度考虑，人们越来越重视生物表面活性剂的开发和应用，以期代替常规的化学合成类表面活性剂，使之广泛用于环境工业、曰用化学拓、食品和医药工业以及农业等领域。
[0003]鼠李糖脂是目前为止研究最为深入的一种阴离子生物表面活性剂，能显著降低水的表面张力改变固体表面的润湿性，具有乳化、破乳、消泡、洗涤、分散与絮凝、抗静电和润滑等多种功能。
[0004]自然界中可以合成鼠李糖脂的微生物很多，其中假单胞菌生产鼠李糖脂的最常用的微生物。假单胞菌(枯草假单胞菌Pseudomonas subtilis、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、恶臭假单胞菌Pseudomonas putida等)可以利用多种碳源为底物合成鼠李糖脂，如葡萄糖、蔗糖、甘油、菜籽油、大豆油等各种植物油。目前，现有专利技术中，鼠李糖脂发酵菌株多采用植物油作为唯一碳源，如专利CN201110158689.7涉及一株铜绿假单胞菌，利用菜籽油作为底物，发酵48h产量达到4.7g/L；专利CN105420137A以75g/L棕榈油为碳源，发酵168h鼠李糖脂含量可达到60g/L以上；再有部分专利技术涉及的菌种采用不同种类植物油作为复合碳源，或者以糖类为底物等，进行发酵生产鼠李糖脂。
[0005]植物油作为碳源发酵产鼠李糖脂的技术工艺已较为成熟，但是植物油的价格劣势带来的高成本一直是困扰该工艺进一步提高的瓶颈。目前，相较于植物油，甘油具有较好的价格优势，开发以甘油为碳源生产鼠李糖脂的菌株及其工艺，将进一步提高鼠李糖脂的应用潜力，具有广阔的应用前景。
发明内容
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种鼠李糖脂的高效发酵工艺，以解决现有技术存在的成本过高，发酵效率较低等问题。
[0007]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0008]一种鼠李糖脂的高效发酵工艺，它包括如下步骤：
[0009](1)将菌种活化后接种于培养基中，培养后得到种子液；
[0010](2)将步骤(1)中所得的种子液接种至发酵培养基中，发酵完成后，取发酵液与正己烷混合后，离心分层得到含鼠李糖脂的发酵液。
[0011]步骤(1)中，所述的菌种为铜绿假单胞菌，优选为铜绿假单胞菌KT1115，菌种保藏号为CCTCC M2016686。
[0012]步骤(1)中，菌种活化的方法为：将保种管从-80℃中取出，置于4℃冰箱缓慢融化，用无菌接种环蘸取融化后的菌液，在LB琼脂平板上划线以分离单菌落，在30℃倒置培养12～16h。挑取单菌落转接到LB琼脂平板上进行二次活化，30℃倒置培养6～8h；挑取二次纯化平板上的单菌落，即可接种于LB液体培养基中。
[0013]其中，LB固体培养基配方为：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉200g/L，pH自然。
[0014]步骤(1)中，所述的培养基为LB液体培养基，配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，pH自然。
[0015]步骤(1)中，培养条件为：在30℃，200rpm下培养22～26h。
[0016]步骤(1)中，接种时，菌体在OD600的吸光度为5.0～6.0。
[0017]步骤(2)中，发酵培养基中的发酵底物为甘油和菜籽油。
[0018]步骤(2)中，发酵培养基的配方为：甘油10～30g/L，菜籽油20～80g/L，酵母提取物3g/L，NaNO3 6g/L，KH2PO4 1g/L，Na2HPO4 1g/L，CaCl2·2H2O 0.11g/L，MgSO4 0.1g/L。[0019]步骤(2)中，接种时，种子液体积为发酵培养基体积的5～7％，优选6％。
[0020]步骤(2)中，发酵的条件为：发酵时间为168～192h；发酵液初始pH值为7.0～7.5，96～120h后控制pH值为6.5～7.0；发酵罐通气比为1.0～1.5v/v·m，搅拌速率为200～400rpm。
[0021]步骤(2)中，发酵的条件优选为：发酵时间为192h；发酵液初始pH值为7.0～7.5，120h后控制pH值为6.5～7.0；发酵罐通气比为1.5v/v·m，搅拌速率为200rpm。
[0022]其中，发酵过程采取泡沫循环策略，在全封闭体系中，将溢出的发酵液泡沫收集液化，再回流到发酵罐中持续发酵。
[0023]步骤(2)中，发酵液和正己烷的体积比为1：1。
[0024]其中，离心分层得到含鼠李糖脂的发酵液的方法为：取发酵液加入正己烷后，混匀，12000rpm离心，发酵液分层，上层为残留菜籽油，中间层为发酵液中含有鼠李糖脂，底部为菌体。
[0025]本发明的有益效果是：
[0026]在鼠李糖脂合成代谢过程中，微生物分泌脂肪酶将植物油降解成脂肪酸和甘油，脂肪酸经过β氧化、或者进一步降解为小分子有机酸经过脂肪酸链从头合成途径，提供鼠李糖脂的前体HAAs；而甘油则经过糖异生等途径合成6-磷酸葡萄糖，经过多步反应生成另一个前体dTDP-L-鼠李糖，两个前体物质在酶催化作用下合成鼠李糖脂。
[0027]目前，鼠李糖脂的生产主要以菜籽油、大豆油、棕榈油等植物油为碳源，这些植物油需要代谢生成甘油和脂肪酸，才能被微生物利用。本发明直接添加甘油作为底物，替代部分植物油，一方面可以降低其原料成本，另一方面微生物不需要首先分解植物油，而是从培养基中直接摄取甘油，进而快速生长繁殖，更短时期内达到理想的生物量，最终达到相当的鼠李糖脂产量。
[0028]本发明的工艺在保持碳源总量不变的情况下，以价格较为低廉的甘油替代部分植物油，其鼠李糖脂发酵产量最高达到53.3g/L左右，而纯菜籽油作为碳源最高可达到55.7g/ L，两者产量接近，但是本发
明具有成本优势。按照工业甘油和菜籽油的市场价格计算，本发明工艺生产1吨鼠李糖脂可节约成本￥2500～2700元，具有更高的市场竞争优势和应用潜力。
附图说明
[0029]图1为实施例2中的种子液生长曲线。
[0030]图2为实施例3不同单一碳源发酵产鼠李糖脂能力测定。
[0031]图3为实施例7和8中的发酵动力学曲线。
[0032]图4为菌株遗传稳定性测试。
具体实施方式
[0033]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
[0034]本发明所述工艺适用于铜绿假单胞菌属，本发明利用的是实验室筛选得到的一株铜绿假单胞菌KT1115，菌种保藏号为CCTCC M2016686。
[0035]以下实施例中所涉及的培养基为：
[0036]LB固体培养基配方为：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉200g/ L，pH自然。
[0037]LB液体培养基配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然。
[0038]实施例1：假单胞菌KT1115平板活化
[0039](1)配制LB固体培养基50mL，置于250mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min，完成后自然冷却至60℃左右。
[0040](2)在超净工作台中准备一次性培养皿若干，每个培养皿倒入约20mL培养基，冷却凝固备用。
[0041](3)将保种管从-80℃取出，置于4℃冰箱缓慢融化，然后用无菌接种环蘸取融化后的菌液，在LB琼脂平板上划线。
[0042](4)平板在30℃恒温培养箱中，倒置培养12～16h后，挑取单菌落转接到LB琼脂平板上进行二次活化，30℃倒置培养6～8h至平板上长出清晰的单菌落。
[0043]实施例2：假单胞菌KT1115发酵种子液制备
[0044](1)配制LB液体培养基150mL，置于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min，完成自然冷却。
[0045](2)制备种子液：接种环挑取实施例1中的二次纯化平板的单菌落，接种于LB液体培养基中，置于30℃恒温振荡器，200rpm培养。
[0046](3)培养20h后，开始取样检测其OD600吸光度，菌体在OD600吸光度5.0～6.0便可接种。
[0047]实施例3单一碳源发酵产鼠李糖脂能力测定
[0048]发酵培养基配方(不包括碳源)为：酵母提取物3g/L，NaNO3 6g/L，KH2PO4 1g/L，
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议