(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.01.22
C N 103529205
A (21)申请号 201310521058.6
(22)申请日 2013.10.29
G01N 33/569(2006.01)
G01N 21/31(2006.01)
(71)申请人中美华世通生物医药科技（武汉）有
限公司
地址430075 湖北省武汉市东湖新技术开发
区高新大道666号光谷生物城B3-4栋
(72)发明人周虎 朱俊铭
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供一种定量测定重组昆虫杆状病毒
滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染
酸性磷酸酶法检测细胞的数量实现定量测定重组
昆虫杆状病毒滴度。该方法灵敏度高，准确性好，
所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗
时较短，效率更高。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书4页 附图1页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页 附图1页(10)申请公布号CN 103529205 A
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1.一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，包括下列步骤：
（a ）将对数生长期的昆虫细胞重悬，用培养基进行适当稀释后接种昆虫细胞于96孔细胞培养板；
（b ）将病毒滴度标准品与待检病毒液进行系列稀释，接种于昆虫细胞进行感染；
（c ）加入底物液，显一定时间后，酶标仪检测光吸收值；
（d ）根据各系列稀释度病毒滴度标准品的光吸收值绘制标准曲线；
（e ）采用标准曲线法，计算待检病毒液的滴度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的重组昆虫杆状病毒是指缺失了多角体蛋白基因的昆虫杆状病毒。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞，包括但不限于Sf9细胞
、Sf21细胞、Hi5细胞，最优选Sf9细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的Sf9细胞接种数量为2×103～3×103个细胞/孔，优选3×103个细胞/孔。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的感染为，15～25℃条件下感染1～2h ，优选在25℃条件下感染2h 。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的培养基为TC-100或Sf-900Ⅱ培养基，优选TC-100培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述TC-100培养基含有1～20%（V/V ）胎牛血清，优选含有10%（V/V ）胎牛血清。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：病毒滴度标准品稀释后浓度范围是
1.9×104～3.0×105pfu/mL 。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述显条件为在37℃条件下作用1h 。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在405nm 下测定光吸收度值。权 利 要 求 书CN 103529205 A
定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及病毒滴度测定，具体地，涉及一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。
背景技术
[0002] 自从80年代初发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特性后，Smith and Summer[Smith GE,MD Summers and MJ Fraser.Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.Mol Cell Biol.1983;3(12):2156-2165]首次建立了杆状病毒表达系统（Baculovirus Expression Vector System，BEVS）。杆状病毒表达系统已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，与大肠杆菌、酵母哺乳动物细胞表达系统相比，BEVS在以下四
（1）作为超高效的真核基因表达系统，生产有用的目的蛋白；个方面具有特殊的研究价值：
（3）研究杆状病毒基因组的结构和功（2）作为基因工程病毒杀虫剂，提高害虫防治效率；
（4）研究真核基因的表达调控机制。杆状病毒表达载体系统已成为研究各种原核蛋白能；
和真核蛋白的非常有效和广泛使用的工具[李卫国，王厚伟，牟志美，石连辉.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望.山东农业大学学报(自然科学版).2003,34(1):134-138]。[0003] 检测病毒滴度的方法有终点稀释法和空斑法。终点稀释法是常用检测病毒滴度的方法，具有简便、快速的特点。它是将病毒进行梯度系列稀释后感染细胞，通过检测50%组织细胞感染量（TCID
）来判定病毒滴度。空斑技术最早是由Dulbecco建立[Dulbecco
50
R.-Production of plaques in monolayer tissues by using single particles of animal virus.Proc Nat Acad Sci1952;38(8):747-752]，Hink和Vial后来把这项技术应用于杆状病毒的研究工作。空斑法是将适量病毒感染细胞后，病毒在感染的细胞内复制、增殖并释放出游离病毒粒子，这些游离病毒粒子由于受到琼脂糖固定培养基的限制，只能感染邻近的细胞。经过几个感染周期以后，这些被感染的细胞均死亡而不被中性红染，周围的活细胞则被染成红，于是在最初被病毒感染的细胞周围形成一个无透明区域，即空斑。通过计数空斑的数量即可判定病毒滴度。
[0004] 对于野生型的昆虫杆状病毒而言，由于其可在感染细胞内形成肉眼可见的包涵体并在短期内将周
围细胞崩解形成明显的空斑，用终点稀释法和空斑法均可以确定其滴度。但是对于重组昆虫病毒而言，由于其缺失了多角体蛋白基因，它不会像野生型的杆状病毒一样在感染细胞内形成肉眼可见的包涵体，因此不能用终点稀释法而只能用空斑法测定重组杆状病毒的滴度。
[0005] 检测重组昆虫病毒的最常用的方法是空斑法，但是由于空斑法操作繁琐，耗时较长（由于其缺失了多角体蛋白基因，其使受感染细胞发生崩解所需的时间也大大延长），且技术较难掌握、误差较大。国外目前有两种检测重组昆虫病毒的方法：一种是通过免疫学方法检测重组杆状病毒感染的细胞表面标志蛋白gp64的表达来确定重组杆状病毒滴度[Dee,K.U,Shuler,M.L.Optimization of an assay for baculovirus titer and
design of regimens for synchronous infection of insect cells.Biotechnol. Prog.1997;13(1):14-24]。该方法简便快速（48h内完成），但价格昂贵；一种是直接将水母绿荧光蛋白（Green Flurescent Protein,GFP）作为报告基因构建重组杆状病毒，使重组杆状病毒筛选和滴度测定都变得极为简单[Takehiko Saito a,Takashi Dojima b,Masaru Toriyama a,Enoch Y.Park The effect of cell cycle on GFPuv gene expression in the baculovirus expression system.Journal of Biotechnology.2002;93(2):121-129]。但该方法涉及到从上游的构建工作做起，工作量巨大。目前尚没有简便、快速地定量测定重组昆虫病毒滴度的方法。
[0006] 因此，本领域中需要一种低成本、简便、快速的方法来定量测定重组昆虫病毒滴度，以利于昆虫杆状表达系统的广泛研究及应用。
发明内容
[0007] 本发明涉及一种定量、简便和快速的方法，用于检测重组杆状病毒的滴度，具体地说，该方法通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量来定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。[0008] 因此，本发明的目的是提供定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量来定量来实现。酸性磷酸酶法测定原理是活细胞内的酸性磷酸酶可以准确反映细胞数。在一定条件下，用去垢剂使细胞膜破裂释放出酸性磷酸酶，再与底物pNPP(对硝基苯磷酸酯)作用一段时间后，即可将其催化生成黄的对硝基酚。这一呈反映可以用酶标仪检测，所测的吸光度即可代表酸性磷酸酶活性，也间接反映了活细胞数。
[0009] 本发明提供了一种通过酸性磷酸酶法定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。包括下列步骤：
[0010] （a）将对数生长期的昆虫细胞重悬，用培养基进行适当稀释后接种昆虫细胞于96孔细胞培养板；
[0011] （b）将病毒滴度标准品与待检病毒液进行系列稀释，接种于昆虫细胞进行感染；[0012] （c）加入底物液，显一定时间后，酶标仪检测光吸收值；
[0013] （d）根据各系列稀释度病毒滴度标准品的光吸收值绘制标准曲线；
[0014] （e）采用标准曲线法，计算待检病毒液的滴度。
[0015] 本发明的实施方案中，其中所述的重组昆虫杆状病毒是指缺失了多角体蛋白基因的昆虫杆状病毒。
[0016] 本发明的实施方案中，所述的昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞，包括但不限于Sf9细胞、Sf21细胞、Hi5细胞，最优选Sf9细胞。使用前应调整细胞生长状态及生长周期，选择生长状态良好、处于对数生长期的细胞用于实验。
[0017] 本发明的实施方案中，Sf9细胞接种数量为2×103～3×103个细胞/孔，优选3×103个细胞/孔。
[0018] 本发明的实施方案中，所述的感染为，15～25℃条件下感染1～2h，优选在25℃条件下感染2h。
[0019] 本发明的实施方案中，所述的培养基为TC-100或Sf-900Ⅱ培养基，优选TC-100培养基。TC-100培养基中可含有1～20%（V/V）胎牛血清，优选含有10%（V/V）胎牛血清。
[0020] 本发明的实施方案中，所述病毒滴度标准品稀释后浓度范围是1.9×104～3.0×105pfu/mL。
[0021] 本发明的实施方案中，所述显条件为在37℃条件下作用1h。
[0022] 本发明的实施方案中，是在405nm下测定光吸收度值。
[0023] 本发明克服了现有技术中的缺点，以滴度对数值和吸光度为坐标轴作图绘制标准曲线，通过计算确定重组昆虫杆状病毒滴度。具体方法为：以标准品的滴度对数值为横坐标，以对应的405nm的吸光度值为纵坐标，根据实验数据绘制标准曲线，求直线回归方程。将测得待检样品的吸光度代入直线回归方程，将计算结果乘以稀释倍数即为滴度。将所有位于标准曲线范围内的待检样品的吸光度值分别计算滴度，相加后取平均数，即为该待检样品的滴度。
[0024] 该方法排除了空斑法通过肉眼打点计数空斑易导致主观误差的缺点，获得的结果更加可观、准确。此方法通过检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。
附图说明
[0025] 图1为根据实施例3所述的检测结果绘制的标准曲线。
具体实施方式
[0026] 下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均
为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。
[0027] 实施例1：细胞接种
[0028] （1）材料Sf9细胞，购自中国典型物菌种保藏中心；TC-100培养基和胎牛血清，购自GIBCO公司；96孔板，购自NUNC公司。
[0029] （2）操作方法
[0030] 取对数生长期的Sf9贴壁生长细胞，轻柔吹打，使细胞重悬。1,000g（水平转头）离心8min。弃上清，将细胞用含10%（V/V）胎牛血清的TC-100培养基重悬，制成细胞悬液。取样，台盼蓝染计数。
[0031] 用含10%（V/V）胎牛血清的TC-100培养基将细胞稀释至3×104个/mL，加入到96孔细胞培养板中，每孔100微升。27℃静置2h。
[0032] 实施例2：重组杆状病毒滴度标准品及待检样品的稀释
[0033] （1）材料TC-100培养基和胎牛血清，购自GIBCO公司；微量移液器，购自EPPENDORF公司；EP管、头，购自AXYGEN公司。
[0034] （2）操作方法
[0035] 用TC-100培养基稀释重组杆状病毒滴度标准品，最高浓度为320倍稀释，以下使用640倍稀释、1280倍稀释等2倍梯度稀释，共8个稀释度；用TC-100培养基稀释待检样品，最高浓度为20倍稀释，以下使用80倍稀释、320倍稀释等4倍梯度稀释，共5个稀释度。[0036] 实施例3：定量测定重组昆虫杆状病毒滴度
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