[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101570566A [43]公开日2009年11月4日
[21]申请号200810043319.7[22]申请日2008.04.30
[21]申请号200810043319.7
[71]申请人上海泽润生物科技有限公司
地址201203上海市浦东新区张江高科技园区张
衡路1399号
[72]发明人史晋 施松明 姚越 刘毅 [74]专利代理机构上海天翔知识产权代理有限公司代理人王裕 吕伴
[51]Int.CI.C07K 1/16 (2006.01)C07K 1/34 (2006.01)G01N 33/68 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 13 页 附图 4 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及Vero细胞
裂解蛋白、制备方法及其用途。本发明公开了一种
制备Vero细胞裂解蛋白的方法，包括下述步骤：Ve
ro细胞培养、收获；细胞裂解；Vero细胞裂解蛋白
的纯化；浓缩处理，即为Vero细胞裂解蛋白。本发
明还公开了上述方法所制备的Vero细胞裂解蛋白及
其用途。本发明所提供了Vero细胞裂解蛋白可作为
免疫原建立Vero细胞HCP的检测方法和检测试验的
标准品。这种方法制备的Vero细胞裂解蛋白应用范
的质量控制与分析，并且灵敏度高，重复性好。
200810043319.7权 利 要 求 书第1/2页
1.一种制备Vero细胞裂解蛋白的方法，包括下述步骤：
a)Vero细胞培养、收获；
b)细胞破碎裂解；
c)Vero细胞裂解蛋白的纯化；
d)浓缩处理，即为Vero细胞裂解蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述细胞破碎裂解包括细胞化学裂解、渗透破碎、反复冻融、细胞酶裂解、超声波破碎或细胞机械裂解。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述细胞破碎裂解为超声波破碎。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述纯化包括粗纯化和精纯化步骤，粗纯化方法可选自等电点沉淀法、盐析法或有机溶剂抽提法中之一；精纯化可选自层析法，包括分子筛层析法、离子交换层析法
、疏水层析法、亲和层析法、金属离子螯合层析法或共价层析法。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述粗纯化方法为有机溶剂抽提法。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述有机溶剂抽提法为破碎后的细胞液加入与等体积的，振摇20分钟，以4000rpm的速度2～8℃离心20分钟，吸取上层蛋白水相。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述精纯化方法为粗纯化后样品用MWCO＝100KD膜超滤，经疏水柱纯化、分子筛层析，收集所需的目的蛋白，所述目的蛋白的收集蛋白峰范围与疫苗生成工艺中病毒及其成分收集峰相同。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述病毒及其成分为甲型肝炎病毒及其成分。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述疏水柱纯化为Phenyl Sepharose 6FF疏水纯化，上样缓冲液流速为30～60cm/h，后以pH值6.0～7.5的1.0mol/L PB溶液淋洗3CV，pH6.0～7.5的0.02mol/L PB溶液线性洗脱5CV，收集电导值低于48mS/cm的洗脱液。所述分子筛层析为Sepharose 4 Fast
200810043319.7权 利 要 求 书 第2/2页
Flow型分子筛凝胶层析，用pH7.4 0.01mol/L PBS溶液以45cm/h的流速进行洗脱，收集第二洗脱峰。
10.按照权利要求1-9任一项方法所制备的V e r o细胞裂解蛋白。
11.根据权利要求10所述的Vero细胞裂解蛋白，其特征在于所述的Vero细胞裂解蛋白为蛋白混合物，分子量范围为11K D、17～34K D 55K D、72KD～170KD。
12.权利要求10所述的Vero细胞裂解蛋白在制备Vero细胞HCP检测试剂中的用途。
200810043319.7说 明 书第1/13页
Vero细胞裂解蛋白、制备方法及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及V e r o细胞裂解蛋白、制备方法及其用途。
背景技术
V e r o细胞(非洲绿猴肾细胞)是一种理想的疫苗生产基质，其遗传背景清楚，核型稳定，无外源因子污染，适合大规模培养，可用生物反应器生产，保证了疫苗大批量生产的均质性和安全性。多年来，国外已成功的研制了多种采用V e r o细胞生产的疫苗并获准上市，包括人用狂犬病纯化疫苗、脊髓灰质炎灭
活(纯化)疫苗(I P V)、乙型脑炎灭活疫苗(J E)。采用V e r o细胞生产的疫苗有两种生产方式：其一为分泌型病毒培养方式(病毒复制完成后，分泌到细胞外的培养液中)；在分泌型病毒培养过程中，其病毒为利用细胞环境进行病毒复制，造成宿主细胞结构受损，导致细胞死亡，致使细胞破裂后释放大量的宿主细胞结构蛋白于培养液中；同时由于细胞生长增殖需要，在V e r o细胞生长增殖的过程中会向培养液中释放大量的促细胞生长因子。其二为非分泌型病毒培养方式，即病毒在宿主细胞内培养(病毒复制完成后，病毒存在于宿主细胞内)，非分泌型病毒如甲肝病毒等在宿主细胞内的培养过程中，病毒的复制不会对宿主细胞产生病变，因此，此类病毒的释放需要采取物理或化学的方法破碎细胞；在收获的病毒液中，除了含有细胞生长增殖过程中释放的促细胞生长因子外，还存在大量的由于细胞破碎而产生的成份更为复杂的细胞裂解蛋白。
经过多年的临床应用，证明V e r o细胞作为疫苗生产基质是安全、有效的。但与此同时，不能排除V e r o细胞生产疫苗在理论上的潜在致肿瘤性风险。控
200810043319.7说 明 书 第2/13页制该风险的措施有两个：其一为控制V e r o细胞的代次在130～150代，其二为降低V e r o细胞残余D N A含量、V e r o细胞残余蛋白含量。鉴于目前国际上尚无特异性V e r o细胞蛋白的检测手段，现仍以疫苗蛋白总量进行间接质量控制。(高恩明e t a l.国家食品药品监督管理局药品评审中心《关于V e r o细胞疫苗残余物质的考虑》，20070112)。而这种情况下，未检出的残余宿主细胞蛋白(H o s t C e l l P r o t e i n，H C P)中的某些组分有可能成为疫苗中的过敏原，因此W H O
于1998年组织制定了《使用动物细胞作为细胞基质生产生物制品规程》，要求将传代细胞H C P含量降低至可接受水平。这一举动表明W H O已开始关注HCP的含量及其对于疫苗安全性的影响。
田博和丁志芬报道了定量检测疫苗中V e r o细胞H C P(田博、丁志芬，中国生物制品杂志.2005，18(2)：159-161，164)；王辉等也报道了疫苗制品中Vero细胞残余蛋白的检测(王辉、张月兰、过琴媛等.中国生物制品杂志.2007，20(2)：937-939，947)。但上述文章中所述Vero细胞残余蛋白检测方法仅针对分泌型病毒培养所制备的疫苗中残余宿主蛋白的检测，并不适用于非分泌型病毒培养所制备的疫苗中残余宿主蛋白的检测。因此，上述文献中所述疫苗中V e r o细胞HCP的检测方法尚存在不足。
目前，市面上也没有出售用于检测V e r o细胞H C P残余量的试剂盒，其原因主要在于H C P残余量检测过程中需要的几种物质难以制备：其中之一就是V e r o细胞裂解蛋白，它可以作为免疫原免疫动物产生抗体-该抗体可用于后续检测反应；并在检测过程中起着试验标准品的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供了检测V e r o细胞H C P的标准品和抗原，以备在疫苗生产和质检中检测Vero细胞HCP残余量。
为了解决上述技术问题，
一方面，本发明公开了一种制备V e r o细胞裂解蛋白的方法，包括下述步骤：
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