(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010077316.6
(22)申请日 2020.01.27
(71)申请人 江苏帆博生物制品有限公司
地址 211300 江苏省南京市高淳区经济开
发区恒盛路5号4幢
(72)发明人 张杰 李永刚
(74)专利代理机构 北京志霖恒远知识产权代理
事务所(普通合伙) 11435
代理人 赵奕
(51)Int.Cl.
C07K 16/02(2006.01)
G01N 33/68(2006.01)
(54)发明名称一种HA阻断剂的制备方法、抗体检测系统(57)摘要本发明属于生物医学技术领域，公开了一种HA阻断剂的制备方法、抗体检测系统，利用浓度为33％-50％的硫酸铵纯化抗体；在得到的纯化抗体中加入戊二醛交联；透析完成后回收抗体并保存；将样品、检测微球、异嗜性抗体干扰指示微球和标记可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系；检测反应体系中第二抗体-抗原-第一抗体-微球四元复合物中微球上的可检测信号，并与标准值或标准曲线比较，确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量。本发明制备的HA阻断剂抗干扰能力强，完全消除HA干扰，不会对免疫检验产生干扰，有效减少假阳性发生率，提高免疫检验的准确度及精准率；本发明的制备方法简单，容易控制，
成本低。
权利要求书3页 说明书10页序列表3页 附图3页CN 111393523 A 2020.07.10
C N 111393523
A
1.一种HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述HA阻断剂的制备方法包括以下步骤：
第一步，将沉淀用原两倍腹水体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液重悬溶解，用0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液进行透析；弃去上清，解透析袋，将抗体转移至烧杯，在搅拌状态下用量筒倒入原腹水体积的饱和硫酸铵溶液，硫酸铵饱和度为33％；搅拌，混匀分装入离心杯，配平，离心，弃去上清，得到纯化抗体；
第二步，将得到的抗体倒入烧杯中，冰浴；将冰浴放在在磁力搅拌器上，搅拌的同时加入25％戊二醛至终浓度为0.4mg/ml；
第三步，慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用PBS缓冲液稀释，加入甘油，再加入Proclin300，保存；
第四步，将HBR稀释液滴加到待测试的含有HA样本的培养基中，每孔中加入HBR稀释液100uL；在空气95％、二氧化碳5％，湿度为70％-80％，温度37摄氏度的环境下进行培养；培养时间为2-3小时；将样品、检测微球、异嗜性抗体干扰指示微球和标记可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系；检测反应体系中第二抗体-抗原-第一抗体-微球四元复合物中微球上的可检测信号，并与标准值或标准曲线比较，确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量。
2.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第一步中硫酸铵纯化抗体具体包括以下步骤：
步骤一，将冷冻的腹水在无菌环境下37℃温浴溶解，用脱脂纱布过滤，量取过滤后的腹水体积，加入等体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液，混匀；
步骤二，在1份腹水中加入1/10份pH8.0的Tris-HCl，温和搅拌；逐渐滴加硫酸铵溶液至饱和度为50％；搅拌1小时，10000r/min，4℃离心20分钟后去除上清，用等体积的硫酸铵重悬沉淀两次后再次离心，并去除上清；
步骤三，将得到的沉淀用原两倍腹水体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液重悬溶解，用0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液进行透析，期间换液三次，换液时间不少于4小时；
步骤四，弃去上清，解透析袋，将抗体转移至烧杯，在搅拌状态下用量筒匀速倒入原腹水体积的饱和硫酸铵溶液，此时硫酸铵饱和度为33％；搅拌1小时，混匀分装入离心杯，配平，10000r/min，4℃离心20分钟，弃去上清。
3.如权利要求2所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述步骤四之后还需进行：将收集到的沉淀用原腹水体积1/2的0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液溶解，用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液进行透析，期间换液3次，换液时间不少于4小时；收集抗体，观察是否有沉淀：如有沉淀，用快速滤纸过滤去除沉淀，量取抗体体积；如无沉淀，直接量取抗体体积，轻轻混匀抗体，使用微量紫外分光光度计测定A280nm的蛋白含量，并记录测量用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液稀释至17mg/ml，使用微量紫外分光光度计在A280模式测定抗体浓度，并记录测量结果。
4.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第二步中戊二醛交联具体包括以下步骤：
步骤一，将得到的抗体倒入烧杯中，冰浴1h；将冰浴放在在磁力搅拌器上，保持冰量没过抗体液面，搅拌的同时加入25％戊二醛至终浓度为0.4mg/ml，加入时间为20s；
步骤二，搅拌下加入2M甘氨酸至终浓度为0.01M，搅拌30min；
步骤三，使用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液对样品进行透析，期间换液二次，换液时间不少于6小时；
步骤四，解透析袋，样品5500r/min，4℃离心18min，取上清，使用紫外分光光度计测定抗体浓度，并记录测量结果。
5.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第三步中慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用PBS缓冲液稀释，加入甘油，再加入Proclin300，保存具体包括以下步骤：慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用0.01MpH7.4的PBS缓冲液稀释至10mg/ml，加入总体积2％甘油，再加入总体积0.1％Proclin300，-20℃保存。
6.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第四步中还包括：将冷冻的HBR室温下放置15分钟解冻，解冻后搅拌至质地均匀，得到HBR结合液；HBR浓度为0.040mg/ml-1.0mg/ml；用稀释缓冲液将HBR结合液补足到100ml，并且进行搅拌、混匀，得到HBR稀释液；将HBR稀释液滴加到待测试的含有HA样本的培养基中，每孔中加入HBR稀释液100uL；在空气95％、二氧化碳5％，湿度为70％-80％，温度37摄氏度的环境下进行培养；培养时间为2-3小时。 7.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第四步中反应体系具体包括：
检测微球是I式所示的第一抗体-微球的二元复合物：
Anti1X-bead(I)
式中，X表示目标抗原，anti1X表示针对所述目标抗原X的第一抗体，bead表示微球，-表示第一抗体与微球之间的结合方式。
8.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第四步中第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位，形成第二抗体-抗原-第一抗体-微球四元复合物；
异嗜性抗体干扰指示微球是II式所示的异嗜性干扰指示物-微球的二元复合物：
Z-bead″(II)
式中，Z表示异嗜性干扰指示物，bead″表示可与bead互相区别的不同微球，-表示异嗜性干扰指示物与微球之间的结合方式，在样品中存在异嗜性抗体的情况下，形成第二抗体-异嗜性抗体-异嗜性干扰指示物-微球四元复合物。
9.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第四步还包括：检测反应体系中第二抗体-异嗜性抗体-异嗜性干扰指示物-微球四元复合物中微球上的可检测信号，得到异嗜性抗体干扰指示微球的信号值，并与无异嗜性抗体干扰效应时的异嗜性抗体干扰指示微球信号值即正常值比较，当异嗜性抗体干扰指示微球测量值大于异嗜性抗体干扰指示微球正常值1.5倍时，则判定目标抗原的测定结果不可靠；如果异嗜性抗体干扰指示微球测量值小于或等于异嗜性抗体干扰指示微球正常值1.5倍时，则判定被检测样品中无异嗜性抗体干扰。
10.一种如权利要求1～9任意一项所述HA阻断剂的制备方法使用的抗体检测系统，其特征在于，所述抗体检测系统包括：
温度控制模块，与检测控制中心连接，用于利用加热器与散热器调控检测环境的温度；
湿度控制模块，与检测控制中心连接，用于利用加湿器、除湿器控制检测环境湿度；
稀释模块，与检测控制中心连接，用于利用水将HBR稀释至指定浓度；
搅拌模块，与检测控制中心连接，用于利用搅拌器将HBR或HBR稀释液搅拌均匀；
检测控制中心，与温度控制模块、湿度控制模块、稀释模块、搅拌模块、时间控制模块、滴加模块、检测模块连接，用于预先设定相关温度、湿度、时间、浓度参数，并调控各个模块完成相应功能；
时间控制模块，与检测控制中心连接，用于利用计时器进行检测过程时间控制；
滴加模块，与检测控制中心连接，用于将稀释好的HBR溶液滴加至含有HA样本的培养基中；
检测模块，与检测控制中心连接，用于利用检测微球、异嗜性抗体干扰指示微球进行抗原检测。
一种HA阻断剂的制备方法、抗体检测系统技术领域
[0001]本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种HA阻断剂的制备方法、抗体检测系统。
背景技术
[0002]目前，最接近的现有技术：阻断剂，也叫受体拮抗剂，指能与受体结合，并能阻止激动剂产生效应的一类配体物质。拮抗剂对相应受体有亲和性，但没有效能，从而抑制了激动剂对受体的作用。拮抗剂可以结合受体的活性位点，也可以结合别构位点，甚至单独结合通常没有生物调节作用的位点来达到效果。拮抗剂和受体结合性质不同，所以结合时间有长有短，结合的可逆性也有不同。拮抗剂分为竞争性拮抗剂和非竞争性拮抗剂等类型。大部分药物拮抗剂都与内源性配体或底物竞争受体结合位点来达到效果。受体是可被配体结合而激活的大型蛋白质分子。受体可以结合在细胞膜上，也可存在于细胞内部，比如在细胞核或线粒体中。受体在活性位点与配体以非共价键结合，一个受体上可以有多个结合不同配体的位点。配体和受体在活性位点或别构位点结合后，都可以调节受体的活性。拮抗剂可以通过结合活性位点、别构位点，或者单独结合通常不参与生物调节的位点来产生效果。血清中的易嗜性抗体(HA)已被证实导致免疫检验的假阳性或是假阴性干扰，在免疫检测结合物中加入阻断剂能够消除HA的干扰。但是，在进行抗体检测中，由于标本中HA的来源是未知的，不能够准确的针对HA的结合位点进行操作，目前尚未有一个完全消除HA干扰的阻断剂。
[0003]现有专利CN201811323185.4异嗜性抗体阻断剂HBR -6及其制备方法，包括其可变区的氨基酸序
列和核苷酸序列，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Phe -Thr -Ala -Asp -Thr -Ser -Ser，CDR2：Glu -Asp -Asp -Pro，CDR3：Val -Leu -Asp -Ser -Asp -Gly -Ser -Tyr；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Asn -Ile -Pro -Lys -Leu -Leu -Ile -Tyr，CDR2：Ile -Val -Met -Thr，CDR3：Gln -Gly -Glu -Asp -Ile -Ala -Thr -Tyr -Arg，制备的异嗜性抗体阻断剂亲和性不好，抗干扰能力不强，不适用于大规模工业化生产。
[0004]现有专利CN201811323396.8异嗜性抗体阻断剂HBT -1及其制备方法，包括其可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Val -Gln -Ser -Ser -Ile -Thr，CDR2：Gln -Asp -Asp -Tyr -Ala -Tyr -Thr -Leu -Tyr，CDR3：Val -Tyr -Lys -Leu；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Gly -Asp -Val -Leu -Ser -Lys -Ser -Cys，CDR2：Lys -Asp -Arg -Phe，CDR3：His -Ile -Ile -Ser -Thr -Ser。制备的抗体亲和性不佳，且工艺复杂，工艺参数难以精准控制。
[0005]综上所述，现有技术存在的问题是：现有的HA阻断剂亲和性不高，无法实现完全消除HA干扰，会对免疫检测结果产生影响；HA阻断剂的制备工艺复杂，难以推广使用。
[0006]解决上述技术问题的难度：目前市场上已经有商品化的HA阻断剂如：IIR、NS -ABT、Heteroblock、MAB33及polyMAB33，其亲和性较差，与HA结合实现减少干扰的效果并不显著，导致错误结果出现；另外，现有的HA阻断剂的制备方法复杂，不适合规模化生产，难以推广使用。
说 明 书
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