(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910115121.3
(22)申请日 2019.02.14
(71)申请人 深伦生物科技（深圳）有限公司
地址 518000 广东省深圳市龙华新区观澜
街道观光路1301号银星科技大厦6楼
606A
(72)发明人 周焱 莫翠萍 舒伟 廖进齐
方崇州 韩倩 刘佳 周光前
(74)专利代理机构 深圳市深弘广联知识产权代
理事务所(普通合伙) 44449
代理人 向用秀
(51)Int.Cl.
C12N 5/10(2006.01)
C12N 5/0735(2010.01)
C12N 5/074(2010.01)
C12N 5/0775(2010.01)C12N 15/85(2006.01)C12N 15/90(2006.01)C12Q 1/02(2006.01) (54)发明名称
其应用
(57)摘要
本发明涉及生物医学技术领域，提供了一种
型HGPS病人来源的外周血单核细胞重编程为中
国HGPS -iPSC；使用CRISPR/Cas9和ssODNs介导的
单核苷酸突变修复技术对LMNA的c.1579C>T
(p.R527C)突变进行修复；并在体外将正常iPSC、
中国HGPS -iPSC和突变纠正iPSC分别分化为功能
性MSCs，检测3种iPSC -MSC中LMNA蛋白的表达、细
胞增值、凋亡、细胞周期和细胞衰老等情况，由此
揭示c.1579C>T(p.R527C)突变对细胞相关通路
信号分子表达功能的影响，研究区别于高加索人
突变型HGPS的中国HGPS的分子机制和致病机
理。权利要求书2页 说明书13页序列表1页 附图1页CN 109777781 A 2019.05.21
C N 109777781
A
权 利 要 求 书1/2页CN 109777781 A
1.一种人多能干细胞衰老模型的制备方法，包括如下步骤：
1)采集正常人和中国HGPS患者的外周血，体外分离并培养扩增原代外周血单核细胞PBMC；
2)正常人iPSC和中国HGPS-iPSC模型构建：包括PBMC体细胞重编程、iPSC克隆挑选和记录、iPSC的扩大培养和冻存；
3)中国HGPS-iPSC基因型鉴定和iPSC鉴定：包括HGPS-iPSC基因型确认、分析LMNA蛋白的表达、iPSC的分子生物学鉴定； 4)CRISPR/Cas9和ssODNs介导的基因编辑修复单位点突变：包括靶标于LMNA基因的gRNAs和ssODN
s设计、sgRNA载体构建、CRISPR/sgRNA活性鉴定、突变纠正的iPSC产生、基因编辑的iPSC克隆挑选和扩增、基因编辑的iPSC克隆的冻存和基因型鉴定；
5)诱导iPSC分化为间充质干细胞(iPSC-MSC)以及表型鉴定：诱导正常iPSC、中国HGPS-iPSC和突变纠正iPSC分化为MSCs、iPSC-MSC鉴定；
6)正常iPSC-MSC、中国HGPS-iPSC-MSC和突变纠正iPSC-MSC生物学特征分析：包括细胞衰老相关蛋白的表达、细胞增殖和凋亡情况、细胞功能稳定性检测、以及衰老涉及的基因和信号通路的研究。
2.根据权利要求1所述的人多能干细胞衰老模型的制备方法，其特征在于：所述人多能干细胞为人诱导性多能干细胞或人胚胎干细胞。
3.根据权利要求1所述的人多能干细胞衰老模型的制备方法，其特征在于：所述人多能干细胞中的LMNA基因的c.1579C>T(p.R527C)纯合突变，单核苷酸错义突变位点位于LMNA基因的9号外显子，导致精氨酸R突变为半胱氨酸C。
4.根据权利要求1所述的人多能干细胞衰老模型的制备方法，其特征在于：步骤4)中所述基因编辑是通过同源重组的方式实现的，所述同源重组中的上游同源臂序列如SEQ ID NO:1所示，所述同源重组中的下游同源臂序列如SEQ ID NO:2所示，筛选标记基因为LMNA基因。
5.利用权利要求1-4中任一所述制备方法获得的人诱导性多能干细胞或人胚胎干细胞。
6.利用权利要求1-4中任一所述制备方法获得的细胞衰老模型，其特征在于：所述细胞衰老模型包括表达靶向LMNA的编码基因的sgRNA载体和表达Cas9的载体。
7.根据权利要求6所述的细胞衰老模型，其特征在于：所述细胞衰老模型包括表达靶向LMNA的编码基因的第9号外显子的sgRNA载体、表达Cas9的载体和含有所述第9号外显子上下游同源臂的DNA片段的载体。
8.权利要求1所述的人多能干细胞在人类儿童早老症细胞模型中的应用。
9.权利要求1所述的人多能干细胞在作为人衰老的临床药物筛选模型中的应用；所述药物为人类儿童早老症的药物。
10.利用权利要求9所述的人多能干细胞筛选人类儿童早老症的药物的方法，包括如下步骤：
1)将权利要求9所述的人多能干细胞在含有待筛选药物的培养液中培养；
2)按照如下确定所述待筛选药物是否为人类儿童早老症的药物：若所述人多能干细胞的衰老表型被逆转，则所述待筛选药物为或候选为人类儿童早老症的药物；若所
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