一种以“关-开”型荧光传感器检测Hg

一种以“关-开”型荧光传感器检测hg
2+
和谷胱甘肽的方法
技术领域
1.本发明涉及一种以“关-开”型荧光传感器检测hg
2+
和谷胱甘肽的方法，属于分析检测领域。

背景技术：

2.谷胱甘肽(gsh)作为生物硫醇的一种，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合构成的三肽。gsh含有游离的巯基，有助于抑制细胞凋亡，并参与构建复杂多维的蛋白质合成，在清除细胞内的自由基、超氧化物和过氧化物等中起着极其重要的作用。研究发现许多疾病的产生与细胞内gsh水平的变化有关，比如一些免疫性疾病、消化系统疾病、心血管疾病、老化病、阿尔兹海默症、癌症等，所以在这些疾病的早期临床诊断领域，非常有必要开发简单且低成本的方法，用于选择性和灵敏地检测生物样品中的谷胱甘肽。此外，随着现代工业的发展，重金属离子污染越发严重。因此，开发一种高效、灵敏、特异性好并且可以检测痕量汞离子的方法必不可少。
3.近年来，已经开发出各种检测gsh的分析方法，主要有高效液相谱法、电化学法、化学发光法等，这些方法虽然具有较高的精度和可靠性，但是存在选择性差、毒性大、灵敏度低和操作复杂等等问题。因此，急需寻一种更加简单、快速、灵敏的gsh检测方法。

技术实现要素：

4.技术问题：
5.目前开发出的各种检测谷胱甘肽的分析方法，主要有高效液相谱法、电化学法、化学发光法等，这些方法存在选择性差、毒性大、灵敏度低和操作复杂等问题。同时，利用荧光传感技术检测血清中谷胱甘肽的报道少并且灵敏度和检出限相对于传统方法不具优势。
6.技术方案：
7.本发明提供一种基于“关-开”型荧光传感器检测hg
2+
和谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：
8.(1)以聚乙烯亚胺和柠檬酸铵为前驱体通过水热法制备碳点溶液；
9.(2)配置不同浓度的hg
2+
标准溶液，将hg
2+
标准溶液、碳点溶液、缓冲液、以及湖水样品混合均匀，得到样品液，孵育，然后进行荧光光谱检测；通过荧光猝灭程度(f
0-f)/f0和hg
2+
标准溶液的浓度构建hg2线性检测模型；其中，f0为hg
2+
浓度为0时的荧光强度；
10.(3)将待测湖水样品与碳点溶液、缓冲液混合，得到湖水待测液，测定湖水待测液的荧光光谱检测，并根据步骤(2)中的hg2线性检测模型得到湖水样品中的hg
2+
浓度；
11.(4)配置不同浓度的谷胱甘肽标准溶液，将谷胱甘肽标准溶液与血清样品混合，获得混合溶液；然后将此混合溶液加入到碳点溶液、hg
2+
溶液、以及缓冲液的混合体系中，混匀，得到最终反应液，孵育，然后进行荧光光谱检测；通过荧光猝灭程度(f
’‑f’0)/f
’0和谷胱甘肽标准溶液的浓度构建谷胱甘肽线性检测模型；其中，f
’0为谷胱甘肽浓度为0时的荧光强度；
12.(5)将待测血清样品加入到碳点溶液、hg
2+
溶液、以及缓冲液的混合体系中，得到血清待测液，测定血清待测液的荧光光谱检测，并根据步骤(4)中的谷胱甘肽线性检测模型得到血清样品中谷胱甘肽的浓度。
13.在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中碳点的制备过程为：将聚乙烯亚胺和柠檬酸铵分散在去离子水，超声处理使混合物充分溶解，之后在180-220℃下进行水热反应，反应结束后，纯化，稀释得到碳点溶液。
14.在本发明的一种实施方式中，聚乙烯亚胺与柠檬酸铵质量比为1:1。
15.在本发明的一种实施方式中，聚乙烯亚胺和柠檬酸铵的总质量与水的用量比为1g/20ml。
16.在本发明的一种实施方式中，水热反应的时间为2-8h。
17.在本发明的一种实施方式中，水热反应的条件具体可选200℃下反应4h。
18.在本发明的一种实施方式中，超声处理的时间为6min。
19.在本发明的一种实施方式中，碳点的纯化步骤为：反应结束获得粗碳点溶液，将该粗碳点溶液以10000rpm离心10min，之后通过0.22μm的微孔滤膜过滤除去未反应完的颗粒，最后用截留分子量为500da的透析膜将碳点透析纯化36h，获得最终碳点。
20.在本发明的一种实施方式中，纯化后的稀释倍数为500倍。
21.在本发明的一种实施方式中，步骤(2)、(4)中进行荧光光谱检测的条件均为：利用荧光光谱仪测得荧光光谱，光谱仪的激发狭缝和发射狭缝宽度均为3.5nm，积分时间为0.1s；荧光光谱仪的激发波长为350nm，发射波长范围为360nm-600nm，步长为1nm。
22.在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中hg
2+
标准溶液、碳点溶液、缓冲液、以及湖水样品的体积比为1：1：1：1。
23.在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中缓冲液为磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)。
24.在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的hg2线性检测模型为：
25.(f
0-f)/f0＝0.02913c(hg
2+
)+0.00622，其中f0和f分别表示hg
2+
浓度为0或不为0时体系的荧光强度，c(hg
2+
)表示hg
2+
的浓度。
26.在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，待测湖水样品、碳点溶液、缓冲液的体积比为1：1：1。
27.在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中所述的线性关系为：
28.(f
’‑f’0)/f
’0＝0.07513c(gsh)-1.92279，其中f
’0和f’分别表示谷胱甘肽浓度为0或不为0时体系的荧光强度，c(gsh)表示谷胱甘肽的浓度。
29.在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中混合溶液中谷胱甘肽标准溶液与血清样品的体积比为1：1。
30.在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中碳点溶液、hg
2+
溶液、以及缓冲液的体积比为1：1：1。
31.在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中缓冲液为磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)。
32.在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中混合溶液与碳点溶液的体积比为2:1。
33.在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中固定hg
2+
溶液的浓度为50μmol/l。
34.在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，待测血清样品、碳点溶液、hg
2+
溶液、缓冲液的体积比为1：1：1：1。
35.有益效果：
36.本发明通过“关-开”型荧光传感器应用于hg
2+
和谷胱甘肽的检测，碳点外观为球形或类球形且表面含有丰富的官能团，提高了碳点的水溶性以及与hg
2+
的结合能力；
37.本发明首次以聚乙烯亚胺和柠檬酸铵为原材料合成的碳点作为荧光传感器先后实现对湖水中hg
2+
和血清中谷胱甘肽的定量检测，且此方法操作简单、快速、安全，适合常规分析。本发明方法中hg
2+
与碳点表面官能团相互作用并发生电子转移引起荧光猝灭，同时也有动态猝灭的作用，对于hg
2+
具有较高的选择性，谷胱甘肽分子中的巯基与hg
2+
具有很强的结合能力，继而使荧光恢复，此传感器可对同一体系中的hg
2+
和谷胱甘肽进行先后检测。
38.本发明检测hg
2+
的线性区间为0-25μmol/l，检出限低至22.45nmol/l；检测谷胱甘肽的线性区间为30-50μmol/l，检出限为61.89nmol/l，这对于环境监测和生物医学领域具有重要意义。
附图说明
39.图1为利用“关-开”型荧光传感器检测hg
2+
和谷胱甘肽的流程图。
40.图2为实施例2中体系中加入不同浓度hg
2+
时的荧光光谱图。
41.图3为实施例2中荧光猝灭程度与hg
2+
浓度的关系曲线。
42.图4为实施例2中荧光猝灭程度与浓度范围为0-25μm的hg
2+
的线性拟合曲线。
43.图5为实施例3中体系中加入不同浓度谷胱甘肽时的荧光光谱图。
44.图6为实施例3中荧光恢复程度与谷胱甘肽浓度的关系曲线。
45.图7为实施例3中荧光恢复程度与浓度范围为30-50μm的谷胱甘肽的线性拟合曲线。
46.图8为实施例4中检测hg
2+
选择性的测试结果图。
47.图9为实施例5中检测谷胱甘肽选择性的测试结果图。
48.图10为实施例6中检测谷胱甘肽时hg
2+
浓度影响的测试结果图。
具体实施方式
49.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
50.实施例1碳点(cds)溶液的制备
51.称量0.5g的聚乙烯亚胺和0.5g的柠檬酸铵于烧杯中，加入20ml去离子水，超声处理6min，使混合物充分溶解，之后在200℃下反应4h。将合成的粗碳点溶液以10000rpm离心10min，之后通过0.22μm的微孔滤膜过滤除去未反应完的颗粒，最后用截留分子量为500da的透析膜将碳点透析纯化36h，获得最终碳点。后续实验的碳点溶液均基于此。
52.实施例2构建hg
2+
的线性测定模型
53.配制样品溶液：碳点溶液(由实施例1所得的最终碳点稀释500倍制得)、磷酸盐缓冲液(ph＝5)、湖水样品和浓度分别为0(空白对照)、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm的hg
2+
标准溶液；
54.将四种物质混合，且碳点溶液、磷酸盐缓冲液、湖水样品和不同浓度hg
2+
标准溶液的体积均为0.4ml，之后用去离子水定容至4ml，静置孵育3min，得到不同hg
2+
浓度的加标湖
水溶液并进行荧光光谱检测，反应温度为20℃；
55.测定体系的荧光光谱：扫描条件：激发波长为350nm，发射波长扫描范围为360-600nm，每隔1nm扫描一次，狭缝宽度设为3.5nm/3.5nm(激发狭缝/发射狭缝)，得到在440nm处荧光强度峰值f(图2)；加入hg
2+
浓度为0的样品溶液进行荧光光谱检测，得到在440nm处荧光强度峰值f0，记录荧光猝灭程度(f
0-f)/f0；
56.绘制样品溶液的荧光猝灭程度与hg
2+
浓度的关系曲线，如图3所示，猝灭程度和hg
2+
的拟合曲线如图4，从图3、图4可以看出：当hg
2+
浓度为0-25μm时，溶液的荧光猝灭程度与hg
2+
浓度成线性关系，线性方程为(f
0-f)/f0＝0.02913c(hg
2+
)+0.00622，相关系数为r2＝0.99967，检测限为22.45nm。
57.实施例3构建谷胱甘肽的线性测定模型
58.配制样品溶液：碳点溶液(由最终碳点稀释500倍)、磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)、hg
2+
标准溶液(50μm)、血清样品和浓度分别为0(空白对照)、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、60μm、70μm、80μm的谷胱甘肽的标准溶液；
59.首先将碳点溶液、磷酸盐缓冲液和hg
2+
标准溶液混合均匀，三者体积均为0.4ml，之后加入不同浓度的谷胱甘肽血清溶液(谷胱甘肽和血清体积均为0.4ml)，最后用去离子水定容至4ml，静置孵育3min，得到不同谷胱甘肽浓度加标的血清溶液并进行荧光光谱检测；
60.测定体系的荧光光谱：扫描条件与检测hg
2+
保持一致，加入谷胱甘肽浓度为0的样品溶液进行荧光光谱检测，得到在440nm处荧光强度峰值f1，加入其它浓度谷胱甘肽的样品溶液得到的荧光强度峰值为f，记录荧光恢复程度(f-f1)/f1，如图5所示；
61.绘制样品溶液的荧光恢复程度与谷胱甘肽浓度的关系曲线，如图6所示，恢复程度和谷胱甘肽的拟合曲线如图7，从图6、图7可以看出：当谷胱甘肽浓度为30-50μm时，溶液的荧光恢复程度与谷胱甘肽浓度成线性关系，线性方程为(f-f1)/f1＝0.07513c(gsh)-1.92279，相关系数为r2＝0.99437，检测限为61.89nm。
62.实施例4探究荧光“关”过程检测hg
2+
的选择性
63.参照实施例2，选用了12种常见的不同金属离子(cu
2+
、fe
3+
、fe
2+
、co
2+
、zn
2+
、k
+
、na
+
、ca
2+
、mg
2+
、mn
2+
、cr
3+
、pb
2+
)作为干扰物质，如图8所示，f0和f分别表示金属离子加入前后的荧光强度。所有阳离子浓度均为60μm，所有荧光检测均在相同条件下进行。
64.根据检测结果可知，部分干扰物质可以在一定程度上猝灭荧光，但是对荧光强度没有明显的影响。
65.实施例5探究荧光“开”过程检测谷胱甘肽的选择性
66.参照实施例3，以16种常见的氨基酸(l-半胱氨酸、d-苯丙氨酸、l-丙氨酸、甘氨酸、l-谷氨酸、dl-甲硫氨酸、l-精氨酸、l-酪氨酸、l-亮氨酸、l-脯氨酸、dl-氨酸、dl-丝氨酸、l-苏氨酸、l-天冬氨酸、l-缬氨酸、l-组氨酸)作为干扰物来研究cds-hg
2+
体系检测谷胱甘肽的选择性，谷胱甘肽和干扰物的浓度均为10μm，hg
2+
浓度均固定为100μm。检测结果如图9所示。
67.根据图像可知，谷胱甘肽和半胱氨酸对于cds-hg
2+
体系的荧光均有明显的恢复作用，其它物质基本上不能使荧光恢复，考虑到无论在血清还是细胞中，生物硫醇(谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸)中谷胱甘肽的含量在90％以上，因此半胱氨酸的存在不影响对谷胱甘肽的检测。
68.实施例6探究检测谷胱甘肽时hg
2+
浓度的影响
69.参照实施例3，将不同浓度(25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm)的hg
2+
标准溶液加入到碳点溶液中，为了在最大程度上提高检测谷胱甘肽的灵敏度，控制谷胱甘肽的浓度为1μm，测得的结果如图10所示，当hg
2+
浓度在50μm时，荧光恢复效果稍微明显，因此，在检测谷胱甘肽时将hg
2+
浓度固定在50μm。
70.实施例7湖水环境中检测hg
2+
71.参照实施例1，测量浓度为10，15，20μm的hg
2+
，检测结果如表1所示。
72.表1实施例7的测试结果
73.加标浓度(μm)检测浓度(μm)回收率(％)相对标准偏差(％),n＝3109.3293.20.97 1515.53103.50.76 2020.02100.10.54
74.实施例8血清环境中检测谷胱甘肽
75.参照实施例2，测量浓度为30，35，45μm的谷胱甘肽，检测结果见表2，检测结果较为满意，说明此方法准确、可行，可应用于生物医学领域检测谷胱甘肽。
76.表2实施例8的测试结果
77.加标浓度(μm)检测浓度(μm)回收率(％)相对标准偏差(％),n＝33029.9499.81.78 3534.6999.11.93 4546.21102.71.91
78.实施例9不同方法检测谷胱甘肽的检测限对比
79.参照实施例3，将本方法获得的检测限与其他荧光检测法进行对比，结果见表3，从表中数据可明显看出，利用聚乙烯亚胺和柠檬酸铵为原材料合成的碳点检测谷胱甘肽，可以获得更低的检测限，证明此碳点对于检测谷胱甘肽的灵敏度高。
80.表3实施例9的对比结果
81.[0082][0083]
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[0084]
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[0085]
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[0086]
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[0087]
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[0088]
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[0089]
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[0090]
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[0091]
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[0092]
对比例1不同碳点的制备
[0093]
碳点a：
[0094]
称量0.6g的聚乙烯亚胺和0.4g的柠檬酸铵于烧杯中，加入20ml去离子水，超声处理6min，使混合物充分溶解，之后在200℃下反应4h。将合成的粗碳点溶液以10000rpm离心10min，之后通过0.22μm的微孔滤膜过滤除去未反应完的颗粒，最后用截留分子量为500da的透析膜将碳点透析纯化36h，得到碳点溶液。
[0095]
将实施例1的碳点与对比例1中的碳点a均稀释100倍在波长为350nm的激发光下进行荧光光谱检测，测试结果发现两者的荧光发射峰位一致，但是实施例1得到的碳点荧光强度比对比例1的强度高，这与两者原材料的用量有关。因此，实施例1中的碳点合成方案更可取。
[0096]
碳点b：
[0097]
称量0.5g的聚乙烯亚胺和0.5g的柠檬酸于烧杯中，加入20ml去离子水，超声处理6min，使混合物充分溶解，之后在200℃下反应4h。将合成的粗碳点溶液以10000rpm离心10min，之后通过0.22μm的微孔滤膜过滤除去未反应完的颗粒，最后用截留分子量为500da的透析膜将碳点透析纯化36h，得到碳点溶液。
[0098]
将实施例1的碳点与对比例1中的碳点b均稀释100倍在波长为350nm的激发光下进行荧光光谱检测，两者的荧光峰位不同，且荧光颜不同，两种碳点各取0.4ml于试管中，分别加入0.4ml 100μm的hg
2+
溶液，用去离子水定容至4ml，孵育3min后进行荧光光谱检测，实施例1得到的碳点体系中荧光猝灭率比对比例1中的高，且猝灭率超过90％。
[0099]
另取两试管，两种碳点各取0.4ml于试管中，分别加入0.4ml 100μm的hg
2+
溶液，再向两试管中分别加入0.4ml 100μm的谷胱甘肽溶液，用去离子水定容至4ml，孵育3min后进行荧光光谱检测，实施例1得到的碳点体系中荧光恢复程度比对比例1中的高，且恢复程度接近100％，即荧光完全恢复。因此，实施例1中的碳点合成方案更可取。
[0100]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：

1.一种基于“关-开”型荧光传感器检测hg
2+
和谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以聚乙烯亚胺和柠檬酸铵为前驱体通过水热法制备碳点溶液；(2)配置不同浓度的hg
2+
标准溶液，将hg
2+
标准溶液、碳点溶液、缓冲液、以及湖水样品混合均匀，得到样品液，孵育，然后进行荧光光谱检测；通过荧光猝灭程度(f
0-f)/f0和hg
2+
标准溶液的浓度构建hg2线性检测模型；其中，f0为hg
2+
浓度为0时的荧光强度；(3)将待测湖水样品与碳点溶液、缓冲液混合，得到湖水待测液，测定湖水待测液的荧光光谱检测，并根据步骤(2)中的hg2线性检测模型得到湖水样品中的hg
2+
浓度；(4)配置不同浓度的谷胱甘肽标准溶液，将谷胱甘肽标准溶液与血清样品混合，获得混合溶液；然后将此混合溶液加入到碳点溶液、hg
2+
溶液、以及缓冲液的混合体系中，混匀，得到最终反应液，孵育，然后进行荧光光谱检测；通过荧光猝灭程度(f
’‑
f
’0)/f
’0和谷胱甘肽标准溶液的浓度构建谷胱甘肽线性检测模型；其中，f
’0为谷胱甘肽浓度为0时的荧光强度；(5)将待测血清样品加入到碳点溶液、hg
2+
溶液、以及缓冲液的混合体系中，得到血清待测液，测定血清待测液的荧光光谱检测，并根据步骤(4)中的谷胱甘肽线性检测模型得到血清样品中谷胱甘肽的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中碳点的制备过程为：将聚乙烯亚胺和柠檬酸铵分散在去离子水，超声处理使混合物充分溶解，之后在180-220℃下进行水热反应，反应结束后，纯化，稀释得到碳点溶液。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，聚乙烯亚胺与柠檬酸铵质量比为1:1。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，聚乙烯亚胺和柠檬酸铵的总质量与水的用量比为1g/20ml。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)、(4)中进行荧光光谱检测的条件均为：利用荧光光谱仪测得荧光光谱，光谱仪的激发狭缝和发射狭缝宽度均为3.5nm，积分时间为0.1s；荧光光谱仪的激发波长为350nm，发射波长范围为360nm-600nm，步长为1nm。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中hg
2+
标准溶液、碳点溶液、缓冲液、以及湖水样品的体积比为1：1：1：1。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，，步骤(3)中，待测湖水样品、碳点溶液、缓冲液的体积比为1：1：1。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中混合溶液中谷胱甘肽标准溶液与血清样品的体积比为1：1；碳点溶液、hg
2+
溶液、以及缓冲液的体积比为1：1：1。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中固定hg
2+
溶液的浓度为50μmol/l。10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，待测血清样品、碳点溶液、hg
2+
溶液、缓冲液的体积比为1：1：1：1。

技术总结

本发明公开了一种以“关-开”型荧光传感器检测Hg

技术研发人员：

陈国庆 李鑫 吴亚敏 马超 李磊 朱纯 辜姣 高辉

受保护的技术使用者：

江南大学

技术研发日：

2022.10.28

技术公布日：

2022/12/19