(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910864683.8
(22)申请日 2019.09.12
(71)申请人 宝船生物医药科技（上海）有限公司
地址 201210 上海市浦东新区春晓路122弄
34号5幢
(72)发明人 李文英 甄滢滢 殷伟 邵喆
黄应峰
(74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司
11332
代理人 巩克栋
(51)Int.Cl.
C12N 15/85(2006.01)
C12N 15/65(2006.01)
C12N 5/10(2006.01)
C12Q 1/02(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种报告基因细胞株及其构
建方法和应用，所述报告基因细胞株包含报告基
元件；所述STAT6信号响应元件包括至少一个拷
贝的STAT6结合基序；所述STAT6结合基序的核苷
酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明报告基因细
胞株适用于评价IL -4与其受体IL -4R的特异性结
合，同时适用于IL -4/IL4Rα抗体阻断IL -4其与 IL -4Rα的结合，监测评估IL -4/IL4Rα抗体的活
性，特异性显著，检测时间短，敏感度高，对监测
评估单克隆抗体的活性具有重要意义。权利要求书2页 说明书7页序列表1页 附图3页CN 110551756 A 2019.12.10
C N 110551756
A
1.一种报告基因质粒，其特征在于，所述报告基因质粒包括STAT6信号响应元件；
所述STAT6信号响应元件包括至少一个拷贝的STAT6结合基序；
所述STAT6结合基序的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的报告基因质粒，其特征在于，所述STAT6信号响应元件包括五个拷贝的STAT6结合基序；
优选地，所述STAT6信号响应元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种报告基因细胞株，其特征在于，所述报告基因细胞株包括如权利要求1或2所述的报告基因质粒；
优选地，所述报告基因细胞株还包括I型IL-4R表达质粒；
优选地，所述I型IL-4R表达质粒包括通过IRES元件串联表达的IL-4Rα和commonγchain；
优选地，所述报告基因细胞株为中国仓鼠卵巢细胞K1。
4.一种如权利要求3所述的报告基因细胞株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
构建报告基因质粒和I型IL-4R表达质粒，转染宿主细胞，抗性筛选后得到所述报告基因细胞株。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述报告基因质粒的构建方法包括以下步骤：
将如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列插入荧光素酶报告基因载体，转化入大肠杆菌克隆菌株，抗性、测序筛选后获得重组质粒，得到报告基因质粒；
优选地，所述荧光素酶报告基因载体为pGL4.23[luc2/minP]；
优选地，所述SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列插入荧光素酶报告基因载体的Acc651和Hind III酶切位点之间。
6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，所述I型IL-4R表达质粒的构建方法包括以下步骤：
(1)将IL-4Rα基因片段插入pcDNA3.3-TOPO载体，转化入大肠杆菌克隆菌株，抗性筛选、测序后获得重组质粒，得到pcDNA3.3-IL4Rα；
(2)将commonγchain基因片段插入pOptiVEC-TOPO载体，转化入大肠杆菌克隆菌株，抗性筛选、测序后获得重组质粒，得到pOptiVEC-TOPO-commonγchain；
(3)以pOptiVEC-TOPO-commonγchain为模板，PCR扩增得到IRES-commonγchain序列，通过Nhe I限制性内切酶位点插入到步骤(1)得到的pcDNA3.3-IL4Rα载体中，得到所述I型IL-4R表达质粒；
优选地，步骤(1)所述IL-4Rα基因片段插入pcDNA3.3-TOPO载体的Xba I和Pme I酶切位点之间；
优选地，步骤(2)所述commonγchain基因片段插入pOptiVEC-TOPO载体的BglII和Pme I酶切位点之间。
7.根据权利要求4-6任一项所述的构建方法，其特征在于，所述抗性筛选采用潮霉素B 和G418的混合液进行。
8.根据权利要求4-7任一项所述的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)构建报告基因质粒：将如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列插入荧光素酶报告基因载
体pGL4.23[luc2/minP]的Acc651和Hind III酶切位点之间，转化入大肠杆菌克隆菌株，抗性筛选后提取质粒，得到报告基因质粒；
(2)构建I型IL-4R表达质粒：
(a)将IL-4Rα基因片段插入pcDNA3.3-TOPO载体的XbaI和Pme I酶切位点之间，转化入大肠杆菌克隆菌株，抗性筛选、测序后获得重组质粒，得到pcDNA3.3-IL4Rα；
(b)将commonγchain基因片段插入pOptiVEC-TOPO载体的BglII和Pme I酶切位点之间，转化入大肠杆菌克隆菌株，抗性筛选、测序后获得质粒，得到pOptiVEC-TOPO-commonγchain；
(c)以pOptiVEC-TOPO-commonγchain为模板，PCR扩增得到IRES-commonγchain序列，通过Nhe I限制性内切酶位点插入到pcDNA3.3-IL4Rα载体中，得到所述I型IL-4R表达质粒；
(3)转染宿主细胞：将构建的报告基因质粒和I型IL-4R表达质粒与Lipofectamine 2000混合，转染中国仓鼠卵巢细胞K1；
(4)抗性筛选：向细胞培养基中加入潮霉素B和G418的混合液，培养后得到所述报告基因细胞株。
9.一种抗体检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括如权利要求1或2所述的报告基因质粒或如权利要求3所述的报告基因细胞株；
优选地，所述检测试剂还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种如权利要求1或2所述的报告基因质粒、如权利要求3所述的报告基因细胞株、如权利要求4-8任一项所述的报告基因细胞株的构建方法或如权利要求9所述的抗体检测试剂在检测靶向IL4&IL-4Rα抗体药物活性中的应用。 一种报告基因细胞株及其构建方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种报告基因细胞株及其构建方法和应用。
背景技术
[0002]近年来，抗体药物以其安全性、有效性和特异性等优点被广泛应用于肿瘤、移植排异、细菌感染和自身免疫等多种疾病的临床。在开发抗体药物时，建立高效快速的抗体药物筛选与评价系统是一个急需解决的问题。现阶段，在体外水平评价抗体药物活性主要采用抗原结合活性实验和细胞增殖抑制实验。抗原结合活性实验虽然能够直接反映抗原与抗体的结合能力，却不能体现抗体药物对细胞增殖的抑制作用；细胞增殖抑制实验虽然直观反映了抗体药物对细胞增殖的抑制效果，但是实验周期长，限制了其广泛应用。Th2细胞通过分泌II型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13，在II型炎症通路中具有关键作用。IL-4可以促进Th细胞分化成为Th2细胞并增殖，Th2细胞进一步分泌产生IL-4、IL-5和IL-13；IL-5可以促进骨髓中嗜酸性粒细胞的分化，IL-4、IL-5和IL-13可以促使嗜酸性粒细胞转移到特定的组织；IL-4和IL-13可以使B细胞产生IgE，IL-13在黏液分泌、杯状细胞增生、平滑肌收缩和胶原产生等方面具有重要作用。
[0003]IL-4和IL-13虽然只有25％的氨基酸同源性，但是它们的受体复合物(I型受体和II型受体)包含共同的组成部分IL-4Rα，I型IL-4R指IL4Rα&commonγchain，II型IL-4R指IL4Rα&IL13Rα。IL-4通过结合I型受体和II型受体，激活下游JAK-STAT6通路发挥作用，而IL-13仅能通过II型受体发挥作用。IL-4和IL4Rα抗体药物通过竞争性结合IL4/IL-4Rα，抑制IL-4与细胞表面IL-4Rα的结合。
[0004]目前，主要通过检测IL-4/IL4Rα抗体药物对TF-1细胞的增殖抑制活性，判断抗体药物的活性，尽管此方法能够直接反映抗体药物对细胞的作用，但是该方法耗时7天，易造成实验结果失真。报告基因系统能够特异性体现抗体药物的作用机理，评价时间短，是良好的评价抗体药物活性的方法，但现今市场上缺乏特异性评价IL-4/IL4Rα抗体药物的报告基因细胞株。
[0005]CN107760760A公开了一种快速测定IL-6/IL-6受体抗体药物生物学活性的方法，所述方法包括构建得到稳定表达SIE报告基因的效应细胞，用IL-6刺激激活报告基因表达，并用IL-6/IL-6R抗体药物阻断IL-6信号通路，根据测定的报告基因信号值拟合四参数曲线确定抗体生物学活性。本发明针对IL-6/IL-6R抗体药物生物学活性测定建立了更加快速、准确的定量检测方法，实验周期短，操作简便，并且避免了长时间孵育所带来的细胞污染可能性等客观因素的问题。然而，所述方法不能用于评价IL-4/IL4Rα抗体药物的活性。[0006]因此，提供一种特异性评价IL-4/IL4Rα抗体药物的报告基因细胞株，用于评价IL-4/IL4Rα抗体药物的生物学活性，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
发明内容
[0007]针对现有技术的不足，本发明提供了一种报告基因细胞株及其构建方法和应用，
所述报告基因细胞株检测时间短，敏感度高，对监测评估单克隆抗体的活性具有重要意义。[0008]为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本发明提供了一种报告基因质粒，所述报告基因质粒包括STAT6信号响应元件；
[0010]所述STAT6信号响应元件包括至少一个拷贝的STAT6结合基序；
[0011]所述STAT6结合基序的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0012]SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为：
[0013]GCTGTTGCTCAATCGACTTCCCAAGAACAG.
[0014]STAT6作为信号转导及转录激活因子家族中的一员，参与到JAK-STAT信号通路，受到IL-4/IL-13的调控，将信号从细胞膜传递到细胞核并激活下游一系列基因的转录表达，在Th2细胞的分化过程中起到关键作用。在本发明中，STAT6结构元件相应细胞膜上IL-4/ IL4Rα信号，通过STAT6结果元件的信号转换，表现为荧光素酶表达的强度，最终被检测用酶标仪捕获信号，形成抗体药物药效学数据。
[0015]优选地，所述STAT6信号响应元件包括五个拷贝的STAT6结合基序。
[0016]STAT6的信号转换的强度和其重复序列的次数相关，兼顾信号响应的强度与线性，5个重复的元件能给充分满足方法检测需要。
[0017]优选地，所述STAT6信号响应元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0018]SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列为：
[0019]GGCCTAACTGGCCGGTACCTGAGCTCGCTGTTGCTCAATCGACTTCCCAAGAACAGGCTGTTGCTCAA TCGACTTCCCAAGAACAGGCTGTTGCTCAATCGACTTCCCAAGAACAGGCTGTTGCTCAATCGACTTCCCAAGAAC AGGCTGTTGCTCAATCGACTTCCCAAGAACAGCTCGAGGATATCAAGATCTGGCCTCGGCGGCCAAGCTTAGACA CT.
[0020]第二方面，本发明提供了一种报告基因细胞株，所述报告基因细胞株包括如第一方面所述的报告基因质粒。
[0021]优选地，所述报告基因细胞株还包括I型IL-4R表达质粒。
[0022]优选地，所述I型IL-4R表达质粒包括通过IRES结构串联表达的IL-4Rα和commonγchain，即I型IL-4R基因。
[0023]本发明中，转染有报告基因质粒和I型IL-4R表达质粒的报告基因细胞株，在细胞膜上表达I型人源IL-4R，胞内表达响应JAK-STAT6信号的荧光素酶，IL-4能够剂量依赖地特异性激活报告基因细胞株的荧光素酶的表达，同时靶向IL-4Rα的抗体药物能够阻断IL-4与报告基因细胞株表面IL-4R的结合，在抗体药物活性检测中具有重要应用。
[0024]本发明中，所述靶向IL-4Rα的抗体药物包括杜普单抗(dupilumab)及其同靶点抗体。
[0025]优选地，所述报告基因细胞株为中国仓鼠卵巢细胞K1(CHO-K1)。
[0026]第三方面，本发明提供了一种如第二方面所述的报告基因细胞株的构建方法，所述方法包括：
[0027]构建报告基因质粒和I型IL-4R表达质粒，转染宿主细胞，抗性筛选后得到所述报告基因细胞株。
[0028]优选地，所述报告基因质粒的构建方法包括以下步骤：
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议