(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510217969.9
(22)申请日 2015.04.24
C12Q 1/02(2006.01)
C12R 1/19(2006.01)
(71)申请人中山大学
地址510275 广东省广州市海珠区新港西路
135号
(72)发明人杜长明 马丹燕 邱培培
(54)发明名称
分析方法
(57)摘要
本发明公开一种等离子体灭菌活性物质作
用因子的定量分析方法，其步骤如下：首先准备
1×1cm 的带菌滤膜块；然后将弯曲尼龙导管一头
接到等离子体消毒器喷嘴处，将导电性能良好的
铁丝筛网覆盖在去盖的培养皿上，保证等离子体
流不是直射培养基，从而屏蔽掉带电粒子和紫外
线，管的另一头置于培养皿中心上方，进行等离子
体处理；等离子体处理后立即将带菌滤膜块进行
稀释和培养，通过与未屏蔽掉带电粒子和紫外线
的等离子体处理效果比较可得到等离子产生的活
性物质灭菌效果。这种方法通过尼龙管和铁丝筛
网屏蔽掉带电粒子和紫外线，较好的实现了等离
子体产生的活性物质定量分析。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书2页 附图2页
(10)申请公布号CN 104805174 A (43)申请公布日2015.07.29
C N 104805174
A
1.一种等离子体灭菌活性物质作用因子的定量分析方法，其特征在于该方法的步骤如下：(1)、将0.5mm直径的0.22微米孔径的混合纤维素酯滤膜剪成1×1cm的滤膜块，然后将菌膜块逐一分装到干燥、无菌的培养皿中，打开培养皿在紫外灯下将滤膜块正反面各灭菌5min待用，然后取10μl上述原始菌液滴在滤膜块上，待液体被滤膜块完全吸收之后进行后续处理；(2)、将弯曲尼龙导管一头接到等离子体消毒器喷嘴处，将导电性能良好的铁丝筛网覆盖在去盖的培养皿上，保证等离子体流不是直射培养基，从而屏蔽掉带电粒子和紫外线，管的另一头置于培养皿中心上方，进行等离子体处理；(3)、等离子体处理后立即将带菌滤膜块放入无菌、装有10ml无菌水的50ml旋口离心管里，每个离心管相对应进行标记编号，将带菌滤膜块、10ml无菌水的离心管用漩涡振荡器振荡60s，并将离心管放到支架上，用移液取900μL的无菌水稀释液注入离心管内，标明稀释倍数；取100μL细菌溶液注入第一个离心管中，并反复，使之混合 均匀，此即稀释至10倍；更换头，从10倍管中取100μL细液放入第二支离心管中并混合均匀，即稀释至100倍，同法可将菌液稀释至10n 倍；(4)、取稀释好的细菌溶液接种培养皿，每个培养皿接种100μL菌液，一式三份，用无菌玻璃棒将液体均匀涂抹于整个培养皿；涂完后将玻璃棒在酒精灯火焰上灼烧灭菌一遍，用酒精棉球擦拭后，然后再在火焰上灼烧一遍，放回支架；(5)将接种后的培养皿倒置于37℃的培养箱中，待培养24h后计数。
一种等离子体灭菌活性物质作用因子的定量分析方法
技术领域
[0001] 本发明属于消毒技术领域，特别是提供了一种等离子体灭菌活性物质作用因子的定量分析方法。
背景技术
[0002] 用于等离子体医学的等离子体源产生的活性物质本质上是由原子氧(O)、羟基自
由基(OH)、过氧化物阴离子(H
2O
2
-)和臭氧(O
3
)等组成。这些从等离子体源中释放出的活性
物质是通过不同反应途径产生的，例如电子碰撞激发以及分解，而且它们在等离子体-表面相互作用中起到了重要作用。这些活性物质中的几种能与生物物质发生反应。OH自由基能够攻击质膜的不饱和脂肪酸。甚至等离子体处理细胞能导致脂质过氧化作用。蛋白质中的氨基酸易于被氧原子以及亚稳态氧分子的氧化。有趣的是氧化应激能够导致细胞内粘附分子功能产生明显或特殊变化，而且氧化应激在导致细胞死亡的凋亡以及坏疽途径中起到了核心作用。所产生的活性物质甚至能够改变细胞的酶活性因为以及证明经过等离子体处理存活的细菌细胞的新陈代谢速率发生了改变。大多数文献认为活性物质可能在所观察到的低温等离子体对细胞作用现象中起到核心作用，然而，对于每种活性物质的准确作用并未达成共识，对等离子体产生的活性物质作用因子的定量研究甚少。
发明内容
[0003] 为解决上述问题，本发明提出一种等离子体灭菌活性物质作用因子的定量分析方法。
[0004] 本发明为达到以上目的，是通过以下的技术方案来实现的：
[0005] 包括的步骤如下：(1)、将0.5mm直径的0.22微米孔径的混合纤维素酯滤膜剪成1×1cm的滤膜块，然后将菌膜块逐一分装到干燥、无菌的培养皿中，打开培养皿在紫外灯下将滤膜块正反面各灭菌5min待用，然后取10μl上述原始菌液滴在滤膜块上，待液体被滤膜块完全吸收之后进行后续处理；(2)、将弯曲尼龙导管一头接到等离子体消毒器喷嘴处，将导电性能良好的铁丝筛网覆盖在去盖的培养皿上，保证等离子体流不是直射培养基，从而屏蔽掉带电粒子和紫外线，管的另一头置于培养皿中心上方，进行等离子体处理；(3)、等离子体处理后立即将带菌滤膜块放入无菌、装有10ml无菌水的50ml旋口离心管里，每个离心管相对应进行标记编号，将带菌滤膜块、10ml无菌水的离心管用漩涡振荡器振荡60s，并将离心管放到支架上，用移液取900μL的无菌水稀释液注入离心管内，标明稀释倍数；取100μL细菌溶液注入第一个离心管中，并反复，使之混合均匀，此即稀释至10倍；更换头，从10倍管中取100μL细液放入第二支离心管中并混合均匀，即稀释至100倍，同法可将菌液稀释至10n倍；(4)、取稀释好的细菌溶液接种培养皿，每个培养皿接种100μL菌液，一式三份，用无菌玻璃棒将液体均匀涂抹于整个培养皿；涂完后将玻璃棒在酒精灯火焰上灼烧灭菌一遍，用酒精棉球擦拭后，然后再在火焰上灼烧一遍，放回支架；(5)将接种后的培养皿倒置于37℃的培养箱中，待培养24h后计数。
附图说明
[0006] 图1为本发明方法的活性物质分离示意图。
[0007] 图中：1等离子体消毒器、2等离子体射流、3尼龙管、4铁丝筛网、5培养皿、6带菌滤膜块。
[0008] 图2为活性物质定量分析图。
具体实施方式
[0009] 实施例
[0010] 在超净工作台中，制备含有大肠杆菌菌种(编号：ATTC25922)的0.22微米孔径的混合纤维素酯滤膜，然后进行定量研究，(1)、将0.5mm直径的0.22微米孔径的混合纤维素酯滤膜剪成1×1cm的滤膜块，然后将菌膜块逐一分装到干燥、无菌的培养皿中，打开培养皿在紫外灯下将滤膜块正反面各灭菌5min待用，然后取10μl(细菌数约为107)上述原始菌液滴在滤膜块上，待液体被滤膜块完全吸收之后(即滤膜上无明显水滴)进行后续处理；
(2)、如附图1，将4cm长的弯曲尼龙导管3一头接到等离子体消毒器1喷嘴处，将导电性能良好的300目铁丝筛网4覆盖在去盖的培养皿5上，保证等离子体流不是直射培养基，从而屏蔽掉带电粒子和紫外线，尼龙管3的另一头置于培养皿5中心上方，保证喷嘴距离皿中心2cm，将气体流量调为5L/min进行灭菌，等离子体射流2处理时间分别取0、30、60、90和120s；(3)、处理后立即将带菌滤膜块放入无菌、装有10ml无菌水的50ml旋口离心管里，注意每个离心管相对应进行标记编号，将带菌滤膜块、10ml无菌水的离心管用漩涡振荡器振荡60s，并将离心管(1.5mL容量)放到支架上，标明稀释倍数，用数字式移液取900μL的无菌水稀释液注入离心管内；取100μL细菌溶液注入第一个离心管中，并反复，使之混合均
匀(漩涡振荡器振荡10s)，此即稀释至10倍；更换头，从10倍管中取100μL细液放入第二支离心管中并混合均匀，即稀释至100倍，同法可将菌液稀释至10n倍；(4)、取稀释好的细菌溶液接种培养皿，每个培养皿接种100μL菌液，一式三份，用无菌玻璃棒将液体均匀涂抹于整个培养皿；涂完后将玻璃棒在酒精灯火焰上灼烧灭菌一遍，用酒精棉球擦拭后，然后再在火焰上灼烧一遍，放回支架；(5)将接种后的培养皿倒置于37℃的培养箱中，待培养24h后计数。细菌数量变化结果如附图2所示，通过与未屏蔽掉带电粒子和紫外线的等离子体处理效果比较发现，屏蔽掉带电粒子和紫外线之后的等离子体处理杀菌能力仍然非常强，证明了等离子体射流中的活性物质是主要杀菌作用因子，通过细菌对数浓度比较可以完成活性物质作用因子的定量分析。
图1
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