(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910091026.4
(22)申请日 2019.01.30
(71)申请人 天津大学
地址 300350 天津市津南区海河教育园雅
观路135号天津大学北洋园校区
(72)发明人 乔建军 许然然 李伟国 闫晓光
梁冬梅 张玉婷
(74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专利代
理事务所 12201
代理人 琪琛
(51)Int.Cl.
C12N 9/88(2006.01)
C12N 15/60(2006.01)
C12N 15/81(2006.01)
C12N 1/19(2006.01)
C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种苦皮藤倍半萜合成酶
CaTPS3及其基因序列，该基因全长1662bp，编码
553个氨基酸，酶蛋白分子量大小为64.06KDa，以
pRS426-URA酵母蛋白表达质粒为载体，以酿酒酵 母Saccharomyces cerevisiae WQ011为宿主，实
现了苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3的异源表达，重
组菌WQ011/pRS426-URA -CaTPS3可以同时生成
α-桉叶醇(α-E u d e s m o l )和愈创醇(5-
Azulenemethanol)两种倍半萜醇。50mL摇瓶产量
为α-桉叶醇0.08mg/L和愈创醇0.25mg/L。该基
远的意义。权利要求书1页 说明书4页序列表4页 附图2页CN 109679943 A 2019.04.26
C N 109679943
A
1.一种苦皮藤倍半萜合成酶，记为CaTPS3，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3的基因，记为CaTPS -25470，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组质粒，记为pRS426-URA -CaTPS3，其特征在于，含有权利要求2所述基因，半乳糖诱导型启动子PGal1,10，尿嘧啶营养缺陷筛选标签。
4.一种重组菌，记为WQ011/pRS426-URA -CaTPS3，其特征在于，含有权利要求3所述重组质粒。
权 利 要 求 书1/1页CN 109679943 A
一种苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3及其基因序列
技术领域
[0001]本发明属于酶基因工程及酶工程领域，具体涉及一种来源于苦皮藤(Celastrus angulatus)的倍半萜
合成酶CaTPS3以及基因序列CaTPS-25470。
背景技术
[0002]萜类化合物是化学结构和构象最为复杂的天然产物，目前发现的萜类化合物有80000种左右，占据天然产物的三分之一，广泛分布于植物和微生物中。萜类化合物的生物合成需要的最基本的结构单元是二甲基烯丙基焦磷酸Dimethylallyl diphosphate，DMAPP 和异戊烯基焦磷酸Isopentenyl diphosphate，IPP来自于甲羟戊酸途径和脱氧木酮糖磷酸酯途径。不同数量的DMAPP和IPP首尾聚合再经过特殊的萜合酶的催化形成单萜(C10)倍半萜(C15)和二萜(C20)等天然产物。倍半萜类化合物是萜类化合物中结构和种类最多的一种，已经被广泛应用于生物制药、天然绿农药杀虫和杀菌剂、燃料替代品和食品级香料和调味剂等行业开发使用。
[0003]α-桉叶醇(α-Eudesmol)和愈创醇(5-Azulenemethanol)等倍半萜类化合物具有显著的生物活性。如α-桉叶醇可以阻断钙离子通道，抑制过度活跃的神经，可以帮助脑部受创后的辅助；愈创醇具有镇咳、祛痰作用，用于支气管炎。
[0004]苦皮藤(Celastrus angulatus)属卫矛科(Celastraceae)南蛇藤属(Celastrus)多年生藤本植物，广泛分布于我国黄河、长江流域的丘陵和山区。苦皮藤的杀虫活性(拒食活性、麻醉活性、毒杀活性)成分主要分布在根皮中。研究证明其中所含的杀虫活性成分主要是以β-二氢沉香呋喃多元醇酯倍半萜类化合物
及其生物碱，取代基的不同决定着化合物的活性不同。目前研究主要集中在对苦皮藤中的有效成分苦皮藤素进行分离与结构鉴定和杀虫作用机理研究，没有对苦皮藤素生物合成中倍半萜合成酶的相关文献。因此研究苦皮藤倍半萜合成酶的功能及其序列特征对萜类化合物的分布具有重要意义。
发明内容
[0005]本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3及其基因序列，还提供了包含本发明基因的质粒及包含该表达质粒的宿主细胞，并利用宿主细胞(重组菌)诱导表达该倍半萜合成酶CaTPS3生成倍半萜类化合物。
[0006]本发明的技术方案是：
[0007]一种苦皮藤倍半萜合成酶，记为CaTPS3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。[0008]编码上述苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3的基因，记为CaTPS-25470，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]一种重组质粒，记为pRS426-URA-CaTPS3，含有编码苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3的基因，半乳糖诱导型启动子PGal1,10，尿嘧啶营养缺陷筛选标签。
[0010]一种重组菌，记为WQ011/pRS426-URA-CaTPS3，含有上述重组质粒。
[0011]本发明的有益效果是：本发明一种苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3及其基因序列，该
基因全长1662bp，编码553个氨基酸，酶蛋白分子量大小为64.06KDa，以pRS426-URA酵母蛋白表达质粒为载体，以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WQ011为宿主，实现了苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3的异源表达，重组菌WQ011/pRS426-URA-CaTPS3可以同时生成α-桉叶醇(α-Eudesmol)和愈创醇(5-Azulenemethanol)两种倍半萜醇。50mL摇瓶产量为α-桉叶醇0.08mg/L和愈创醇0.25mg/L。该基因的获得对倍半萜的生产及运用具有重要意义，同时该基因的获得对苦皮藤倍半萜化合物的形成机制和生物胁迫机理研究奠定基础。
附图说明
[0012]图1为WQ011/pRS426-URA-CaTPS3重组酵母菌株验证DNA琼脂糖凝胶图谱(目的条带大小为1662bp)；
[0013]M：标准DNA分子尺；泳道1为CaTPS-25470基因DNA样品；
[0014]图2为外标法标准曲线；
[0015]图3为WQ011/pRS426-URA-CaTPS3重组酵母菌株产物GC-MS图谱；
[0016]A为发酵产物的GC图谱；B为保留时间11.82min峰的质谱图和NIST14谱库中α-桉叶醇质谱图比较；C为保留时间12.05min峰的质谱图和NIST14谱库中愈创醇质谱图比较。
具体实施方式
[0017]下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0018]本发明倍半萜合成酶基因来源于苦皮藤植株，植物在2017年5月11日采集于陕西省杨凌示范区西北农林大学博览园。
[0019]选用新鲜采集的苦皮藤植株进行RNA提取，并通过反转录PCR获得其cDNA序列，构建c D N A文库。使用Pa c B i o I S O-S e q平台进行测序，通过在I n t e r p r o(h t t p:// www.ebi.ac.uk/interpro)中进行BLAST比对获得具有PF_03936Terpene synthase family 结构域的目的基因。以cDNA序列为模板，设计引物扩增CaTPS-25470基因序列，并通过酶切连接到WQ011/pRS426-URA-CaTPS3质粒上获得pRS426-URA-CaTPS3酵母宿主表达质粒。采用醋酸锂酵母化学转化法，将重组质粒pRS426-URA-CaTPS3转化如酿酒酵母宿主WQ011，通过URA缺陷型筛选平板，筛选获得WQ011/pRS426-URA-CaTPS3重组酵母菌株，实现苦皮藤的倍半萜合成酶CaTPS3的高效表达。
[0020]实施例1.所述的WQ011/pRS426-URA-CaTPS3菌株苦皮藤倍半萜合成酶基因CaTPS-25470的克隆及表达
[0021]采用RNAprep pure Plant Kit提取苦皮藤总RNA。采用Clontech SMARTer PCR cDNASynthesis K
it合成第一链cDNA，第一链cDNA经过PCR扩增合成第二链cDNA，然后双链DNA经过二次PCR扩增后，用于SMRTbell建库，并采用PacBio ISO-Seq平台进行测序。[0022]根据测序获得的CaTPS-25470基因序列SEQ ID NO.2，设计引物扩增目的基因，引物序列如下：
[0023]引物CaTPS-25470-F:5'CGCGGATCCATGGCAGCAACCACCCAATC 3'(SEQ ID NO.3) [0024]引物CaTPS-25470-R：5'CCGCTCGAGTTAATCTTGCATTGGTATTTGTTGA3'(SEQ ID NO.4) [0025]以反转录获得的cDNA序列为模板，采用上述引物，PCR扩增CaTPS-25470基因序列。反应体系为50ul，包括ddH2O 18ul，dNTP mixture 1ul,CaTPS-25470-F引物1ul，CaTPS-
25470-R引物1ul，DNA模板1ul，2×Phanta Max 25ul，Fidelity DNA polymerase 1ul。扩增过程为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃终延伸5min。
[0026]PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶检测条带大小，用Universal DNA Purification Kit回收目的片段。
[0027]用BamHI和XhoI酶切纯化的DNA片段和pRS426-URA质粒，酶切后的产物经过Universal DNA Purification Kit回收得到酶切片段，经过T4 DNA ligase连接酶进行连接，得到重组质粒。酶切体系为：BamHI1.5μL，XhoI 1.5μL，DNA片段或质粒42μL，cut smart buffer 5μL。37℃水浴2h。连接体系为：目的酶切基因片段7μL与酶切质粒1μL，T4连接酶1μL，10×T4 ligase buffer1μL。16℃过夜连接。
[0028]采用醋酸锂转化法，进行酵母转化，操作步骤如下：
[0029](1)酿酒酵母菌株WQ011划线YPD平板，30℃培养，至长出单菌落约1-3mm。从YPD平板挑取一环酵母菌接种于含有5mL YPD液体培养基中，180r/min，30℃，摇床培养14～16h。[0030](2)按照1％接种量，将菌液接入50mL YEPD液体培养基中，180r/min，30℃培养至OD600＝0.5(约3-5h)。
[0031](3)5000r/min，4℃冷冻离心6min，收集菌体。
[0032](4)加入25mL无菌去离子水悬浮菌体，5000r/min，4℃冷冻离心6min。
[0033](5)重复上一步操作一次。
[0034](6)用1mL浓度为0.1mol/L的LiAc缓冲液重悬菌体，静置5min。5000r/min，4℃冷冻离心5min后，弃去上清。
[0035](7)用500μL 0.1mol/L的LiAc缓冲液重悬菌体，每100μL分装到一个离心管中，制成酵母感受态细胞。
[0036](8)ssDNA经过煮沸12min后冰上迅速冷却。
[0037](9)在分装好的酵母感受态细胞中，加入100-500ng的载体或线性DNA。之后旋转加入如下混合物中。转化混合物的成分如下：1)PEG-4000 50％(w/v)，620μl；2)LiAc1.0mol/ L，90μl；3)SS-DNA(10mg/ml)，40μl。
[0038](10)30℃培养箱中孵育30min。
[0039](12)42℃水浴热激20min。
[0040](15)6000r/min离心1min，弃掉部分上清液，重悬菌体，取100μL涂板，30℃培养2-3天，长出转化子。
[0041](16)挑取少许单菌落，加入50μl除菌的20mM NaOH溶液混匀。
[0042](17)置于PCR仪中，按照程序：99℃，5min；4℃，1min循环3次。
[0043](18)取出菌液，8000r/min离心5分钟，取上清作为PCR模板。
[0044](19)反应体系为10ul，包括CaTPS-25470-F引物1ul，CaTPS-25470-R引物1ul，DNA 模板3ul，2×Taq Master Mix 5ul。扩增过程为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃终延伸5min。
[0045](20)PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶检测条带大小是否正确。
[0046]结果表明(如图1所示)：挑选的转化子在1200bp和2000bp之间有单一条带，证明转化子为阳性克隆子。
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