(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910261027.9
(22)申请日 2019.04.02
(71)申请人 浙江物种链生物科技有限公司
地址 322000 浙江省金华市义乌市北苑街
道柳青路1059号1单元301室
申请人 中国热带农业科学院热带生物技术
研究所
(72)发明人 夏志强 邹枚伶
(74)专利代理机构 深圳中一联合知识产权代理
有限公司 44414
代理人 张威
(51)Int.Cl.
C12N 15/11(2006.01)
C12Q 1/6869(2018.01)
(54)发明名称测序引物组及基于PCR的全基因组测序方法(57)摘要本发明提供了一种测序引物组，所述测序引物组包括通用上游引物、通用下游引物及富集启动子下游引物；以及一种基于PCR的全基因组测序方法，其包括利用所述通用上游引物和通用下游引物对所述待测样品的DNA进行第一PCR扩增得到第一扩增产物，利用所述通用上游引物和所述富集启动子下游引物对所述待测样品的DNA进行第二PCR扩 增得到第二扩增产物；再同时进行测序的方法，上述方法通过优化引物，可以任意调节基因组大小和样品量的大小，同时对DNA质量要求不高；建库更加简洁；不需要已知SNP标记，不需要前期构建芯片；具有基因区富集效，可
以满足对全基因组检测筛选。
权利要求书2页 说明书9页序列表2页 附图2页CN 111763668 A 2020.10.13
C N 111763668
A
1.一种测序引物组，其特征在于，所述测序引物组包括通用上游引物、通用下游引物及富集启动子下游引物；
所述通用上游引物的序列包括：5’-T[barcode]CAAAXXXXNNN-3’；
所述通用下游引物的序列包括：5’-GACTGCGTACGZZZZNNN-3’；
所述富集启动子下游引物的序列包括：5’-GACTGCGTACYYNCTATA-3’；
其中，所述“XXXX”的长度为4个碱基，且碱基选自A、T、C和G中的至少一种；所述“ZZZZ”的长度为4个碱基，且碱基选自A、T、C和G中的至少一种；所述“barcode”的长度为4～6个碱基，且碱基选自A、T、C和G的至少一种；所述“N”为碱基A、T、C和G中的任意一种，所述“Y”为碱基C或T。
2.根据权利要求1所述的测序引物组，其特征在于，所述测序引物组中，
所述通用上游引物的序列为：5’-T[barcode]CAAACCGGNNN-3’，所述通用下游引物的序列为：5’-GACTGCGTACGAATTNNN-3’；或者，
所述通用上游引物的序列为：5’-T[barcode]CAAACGCGNNN-3’，所述通用下游引物的序列为：5’-GACTGCGTACGTATANNN-3’。
3.根据权利要求1或2所述的测序引物组，其特征在于，所述“barcode”选自CTTAT、GTAGA、CCTCG、GAACT和TTACT中的至少一种。
4.一种基于PCR的全基因组测序方法，其包括如下步骤：
制备待测样品的DNA；
提供权利要求1-3任一项所述的测序引物组，利用所述通用上游引物和通用下游引物对所述待测样品的D
NA进行第一PCR扩增得到第一扩增产物，利用所述通用上游引物和所述富集启动子下游引物对所述待测样品的DNA进行第二PCR扩增得到第二扩增产物；
将所述第一扩增产物、第二扩增产物分别进行测序分析。
5.根据权利要求4所述的基于PCR的全基因组测序方法，其特征在于，所述第一PCR扩增的步骤包括：
先进行使通用上游引物和通用下游引物结合到所述待测样品的DNA上的结合扩增，然后进行富集目标区域的富集扩增。
6.根据权利要求5所述的基于PCR的全基因组测序方法，其特征在于，所述结合扩增包括94℃，5分钟；5个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；35℃，1分钟；72℃，1.5分钟；和/或，所述富集扩增包括35个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；50～58℃，1分钟；72℃，1.5分钟；72℃，7分钟。
7.根据权利要求4所述的基于PCR的全基因组测序方法，其特征在于，所述第二PCR扩增的步骤包括：
先进行使通用上游引物和富集启动子下游引物结合到所述待测样品的DNA上的结合扩增，然后进行富集目标区域的富集扩增。
8.根据权利要求7所述的基于PCR的全基因组测序方法，其特征在于，所述结合扩增包括94℃，5分钟；
5个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；35℃，1分钟；72℃，1.5分钟；和/或，所述富集扩增包括35个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；50～58℃，1分钟；72℃，1.5分钟；72℃，7分钟。
9.根据权利要求4-8任一项所述的基于PCR的全基因组测序方法，其特征在于，所述制
备待测样品的DNA的方法选自全基因组DNA提取方法、PCR试剂盒扩增法和制备裂解液裂解组织法中的任意一种。
10.根据权利要求4-8任一项所述的基于PCR的全基因组测序方法，其特征在于，将所述第一扩增产物定量至浓度为180-200ng/μL，以及将所述第二扩增产物定量至浓度为180-200ng/μL后，再分别进行测序分析。
测序引物组及基于PCR的全基因组测序方法
技术领域
[0001]本发明涉及基因测序领域，尤其涉及一种测序引物组及基于PCR的全基因组测序方法。
背景技术
[0002]基因分型是一系列遗传分析，包括利用高通量测序技术进行分子标记发现和基因分型，最强大的应用之一是植物育种领域，为植物育种和植物遗传学研究开辟了新的可能性。它提供经济高效的全基因组扫描和多重测序平台。简化测序技术是高通量测序的新应用，用于挖掘物种体中的单核苷酸多态性(SNP)并对其进行基因分型。需要生物信息学工具来分析和解析简化测序数据集。是低成本的技术和优秀的MAS工具，简化测序目前已成功应用于大规模植物分子育种策略中的全基因组关联分析研究，分子标记挖掘，遗传连锁图谱，基因组遗传选择和体基因组多样性研究。
[0003]简化基因组测序是在第二代测序基础上发展起来的一种利用酶切技术、序列捕获芯片技术或其他实验手段降低物种基因组复杂程度，对基因组特定区域进行测序，进而反映部分基因组序列结构信息的测序技术。目前发展起来的简化基因组测序有：复杂度降低的多态序列测序，限制性酶切位点相关的DNA测序，基因分型测序等。
[0004]一个简单的，快速和低成本有效的系统，已经用于在非模式生物的测序。其中运用最为广泛的是限制性酶切位点相关DNA的测序技术，该技术利用限制性内切酶对基因组进行酶切、产生一定大小的片段、构建测序文库、对酶切后产生的限制性酶切位点标记进行高通量测序。由于限制性酶切位点标记是全基因组范围的呈现特异性酶切位点附近的小片段DNA标签，代表了整个基因组的序列特征，因此通过对限制性酶切位点标记测序能够在大多数生物中获得成千上万的单核苷酸多态性标记。
[0005]基于测序的基因分型是高通量测序方案的新应用，用于发现和基因分型用于作物改良的单核苷酸多态性。简化测序的低成本使其成为一种有吸引力的方法，可以通过高密度的单核苷酸多态性标记来完全绘制和繁殖种。测序和碱基调用软件的不断改进将使高通量测序技术能够为每次运行提供更高的测序通量，从而实现更深的多重化，以获得每个样品的固定平均测序深度。随着每次运行产生的序列信息的数量和质量不断增加，这使得每个样本的plex更高且成本更低，简化测序已成为其他全基因组基因分型平台的成本竞争性替代品。植物育种者将能够对大型作物基因组进行测序，并从繁殖种中建立高密度的遗传连锁图谱。简化测序未来在作物改良中的应用可能允许植物育种者在新的种质或物种上进行标记，而无需先开发任何先前的分子工具。由于基于序列的基因分型可用于整个基因组研究，简化测序将成为植物遗传学和育种的主要组成部分之一。
[0006]通过简化测序鉴定高密度单核苷酸多态性标记以构建遗传谱图对于植物育种中的众多应用具有重要价值。
[0007]基因分型芯片是利用已知的单核苷酸多态性的位点侧翼的序列设计探针。探针固定在芯片上后，待测定样本的DNA与芯片杂交并扫描杂交荧光信号，从而鉴定这些探针位点
(单核苷酸多态性的位点)的基因型。最有代表性的品牌是illumina和affymetrix。[0008]单核苷酸多态性的芯片已成为作物遗传改良的重要工具。分子育种时代已经全面到来，为了解决分子标记检测手段的不足，
传统育种周期长、不可预见，全凭育种家的经验和肉眼筛选。可把大田搬到实验室，进行大规模精准筛选，排除95％以上的单株，剩下少量单株种到大田，大大减少了田间工作量。原方法一个品种平均8到10年的育种周期，该方法3到5年就可完成。
[0009]目前芯片其在育种材料的快速鉴定、基因组选择、种质资源分析、品种改良、QTL定位、遗传分析、品种的真实性鉴定等方面有非常高的实用价值，并且具有极大的成本优势。但是，目前芯片的使用存在一些困难限制了芯片在作物遗传改良的广泛引用。主要困难有：(1)目前芯片前期研发成本较高，需要有已经测序的参考基因组和已知SNP标记；仅仅能够检测已知SNP位点，得到标记数量较少；仅仅能够检测已有SNP标记，无法发现新的SNP位点；检测手段仪器依耐性较高；目前仅仅几个育种的模式物种有相应的芯片；(2)简化测序成本还不够低，因为建库繁琐其效率不够高，对于育种大样本的检测很难广泛使用；由于都需要酶切方法，所以简化测序对DNA质量要求较高，无法使用直接解列的DNA(直接PCR)；建库中出现样本之间测序量不均一特征，需要补充测序；没有基因区的富集效应。
发明内容
[0010]本发明的目的在于提供一种测序引物组及基于PCR的全基因组测序方法，旨在解决现有芯片筛选基因组中SNP位点速度慢、要求高、操作复杂的技术问题。
[0011]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0012]一种测序引物组，所述测序引物组包括通用上游引物、通用下游引物及富集启动子下游引物；
[0013]所述通用上游引物的序列包括：5’-T[barcode]CAAAXXXXNNN-3’；
[0014]所述通用下游引物的序列包括：5’-GACTGCGTACGZZZZNNN-3’；
[0015]所述富集启动子下游引物的序列包括：5’-GACTGCGTACYYNCTATA-3’；
[0016]其中，所述“XXXX”的长度为4个碱基，且碱基选自A、T、C和G中的至少一种；所述“ZZZZ”的长度为4个碱基，且碱基选自A、T、C和G中的至少一种；所述“barcode”的长度为4～6个碱基，且碱基选自A、T、C和G的至少一种；所述“N”为碱基A、T、C和G中的任意一种，所述“Y”为碱基C或T。
[0017]以及，一种基于PCR的全基因组测序方法，其包括如下步骤：
[0018]制备待测样品的DNA；
[0019]提供上述任一项所述的测序引物组，利用所述通用上游引物和通用下游引物对所述待测样品的DNA进行第一PCR扩增得到第一扩增产物，利用所述通用上游引物和所述富集启动子下游引物对所述待测样品的DNA进行第二PCR扩增得到第二扩增产物；
[0020]将所述第一扩增产物和第二扩增产物分别进行测序分析。
[0021]本发明提供的测序引物组包括特有序列的通用上游引物、通用下游引物及富集启动子下游引物，其中，通用上游引物和通用下游引物分别包括四个碱基：“XXXX”和“ZZZZ”(碱基均选自A、T、C和G中的至少一种进行组合)，这八个碱基为通用引物的核心碱基区域，可以根据待测样品基因组的变化而变化，根据碱基的不同，使之能够扩增不同基因组上不
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