(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利
(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 202011638901.5
(22)申请日 2020.12.31
(65)同一申请的已公布的文献号
申请公布号 CN 112552393 A
(43)申请公布日 2021.03.26
(73)专利权人 西安德诺海思医疗科技有限公司
地址 710000 陕西省西安市沣东新城科源
三路137号康鸿橙方科技园1号楼B单
元1层B单元2层B单元3层
(72)发明人 杨鹭 黄文涛
(74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任
公司 61200
代理人 范巍
(51)Int.Cl.
C07K 14/78(2006.01)
C12N 15/81(2006.01)
C12N 15/12(2006.01)
C12N 1/19(2006.01)
A61L 27/24(2006.01)
A61K 8/65(2006.01)A61Q 19/00(2006.01)C12R 1/84(2006.01)(56)对比文件CN 102443057 A ,2012.05.09US 2020032209 A1,2020.01.30US 2008107666 A1,2008.05.08刘晗等.低亚氨基在胶原异源三聚体中倾向性的测定.《华中农业大学学报》.2020,(第03期)，史静静等.毕赤酵母中人Ⅲ型胶原蛋白α链与病毒羟脯氨酸酶的共表达.《西北大学学报(自然科学版)》.2017,(第02期),Andrzej Fertala等.Three Decades of Research on Recombinant Collagens: Reinventing the Wheel or Developing New Biomedical Products?.《MDPI》.2020，审查员 贾麒 (54)发明名称 重组表达系统
(57)摘要
本发明公开了一种重组人源III型胶原蛋白
及其毕赤酵母重组表达系统。本发明将人源III
型胶原蛋白部分肽段中含有缬氨酸、苯丙氨酸、
亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸的Gly ‑X ‑Y结构肽以使
用频率较高的不含上述氨基酸的Gly ‑X ‑Y结构肽
替换，根据替换后肽段获得编码肽段的基因序
列，然后构建用于串联表达不同重复数目肽段的
基因表达载体并转化毕赤酵母宿主菌，筛选获得
高表达重组人源III型胶原蛋白的菌株。本发明
通过蛋白结构的人工设计优化，有效解决天然胶
原在发酵中发生降解的问题，表达产物稳定性
高、生物相容性好，
可用于大规模生产。权利要求书1页 说明书7页序列表2页 附图5页CN 112552393 B 2022.02.01 C N 112552393
B
1.一种重组人源III型胶原蛋白，其特征在于：该重组人源III型胶原蛋白包括重复串联的单体，所述单体为突变的人源III型胶原蛋白氨基酸序列片段，单体的突变位点为人源III型胶原蛋白氨基酸序列片段中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸的Gly ‑X ‑Y三肽重复序列，将这些Gly ‑X ‑Y三肽重复序列替换为天然人源III型胶原蛋白螺旋区使用频率≥3次的不含上述氨基酸的Gly ‑X ‑Y三肽重复序列；
所述单体的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1的第2~169位。
2.根据权利要求1所述一种重组人源III型胶原蛋白，其特征在于：所述重组人源III型胶原蛋白中，单体的串联个数为2~10。
3.根据权利要求2所述一种重组人源III型胶原蛋白，其特征在于：所述重组人源III型胶原蛋白的分子量为10KD ~100KD。
4.一种表达如权利要求1所述的重组人源III型胶原蛋白的菌株，其特征在于：该菌株是转化有重组人源胶原蛋白基因表达载体的野生型或突变型巴斯德毕赤酵母（Pichia
pastoris ）
，所述表达载体包括重组人源胶原蛋白基因表达盒，所述表达盒包括目的基因序列，所述目的基因序列包括用于对单体进行重复串联表达的DNA序列，所述单体为突变的人源III型胶原蛋白氨基酸序列片段，单体的突变位点为人源III型胶原蛋白氨基酸序列片段中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸的Gly ‑X ‑Y三肽重复序列，将这些Gly ‑X ‑Y三肽重复序列替换为天然人源III型胶原蛋白螺旋区使用频率≥3次的不含上述氨基酸的Gly ‑X ‑Y三肽重复序列。
5.根据权利要求4所述的菌株，其特征在于：所述单体的编码序列为SEQ.ID.NO.2的第16~519位。
6.一种重组人源III型胶原蛋白的生产方法，其特征在于：包括以下步骤：
以底料对权利要求4所述的菌株进行发酵，在发酵过程中通过添加甲醇诱导该菌株表达重组人源III型胶原蛋白。
7.一种用于组织工程、美容产品的生物材料，其特征在于：该生物材料包括权利要求1‑3中任意一项所述的重组人源III型胶原蛋白。
权 利 要 求 书1/1页CN 112552393 B
一种重组人源III型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统
技术领域
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及利用毕赤酵母表达重组人源III型胶原蛋白。
背景技术
[0002]胶原蛋白(collagen)是体内含量最多的一种蛋白质，是细胞外基质(ECM)的主要成分，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复具有重要作用，已广泛应用于医药、保健品及化妆品行业中。在分子结构上，每条胶原肽链主要由Gly‑X‑Y结构肽构成(X、Y是Gly之外的任何氨基酸残基)，这种肽链结构是形成胶原纤维高级结构所必需的，决定了胶原蛋白优良的生物相容性和低免疫原性。
[0003]胶原蛋白的主要来源是从动物组织中提取，而随着生物技术的发展，利用基因重组技术，通过微生物发酵法获得重组胶原蛋白，解决了传统提取法存在的病毒隐患，同时与天然胶原蛋白相比，人工设
计的重组胶原蛋白的亲水性和生物相容性显著提高。但研究表明利用重组菌株，例如，毕赤酵母基因工程菌表达胶原蛋白时，在发酵过程中重组菌株表达的胶原蛋白会出现明显的降解现象，不利于后续的纯化及应用，同时也提高了胶原蛋白的生产消耗和成本。
[0004]中国专利CN111647089A公开了一种重组类人弹性蛋白及其组合物，通过短重复氨基酸序列串联(重复3～7次)构成目的蛋白多肽序列，具有较好的耐降解性能，催化活性较单一原始片段保持更久。但是短重复氨基酸序列串联导致重组蛋白与天然蛋白序列同源性降低，并不适合作为与生物体长期接触的生物材料进行应用。
[0005]中国专利CN109680025A公开了一种提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵工艺，其在甲醇诱导培养阶段(90～120小时)向发酵培养基中加入柠檬酸铵，可以提高重组人源胶原蛋白的生物合成速率，缩短发酵时间，同时也提高了重组人源胶原蛋白在发酵液中的稳定性。但随着重组人源蛋白与发酵液分离，仍无法解决重组人源胶原蛋白在下游纯化过程及应用过程中的稳定性问题。
[0006]中国专利CN103102407A中提供了一种酵母基因工程菌，其可以表达带有特异性亲和纯化标记和两段相同的人源III型胶原蛋白片段的基因重组类人胶原蛋白。该专利采用与天然胶原的部分肽段序列完全相同的两段序列(通过EFT连接)构建重组蛋白，但从结果电泳图中可以看出目的蛋白附近有明显的降解片段。同时，虽然使用特异性纯化标记可获得纯度较高的目的蛋白，但纯化标记会影响蛋白的免疫原性，从而影响蛋白的应用。
发明内容
[0007]本发明的目的在于提供一种重组人源III型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统。
[0008]为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0009]一种重组人源III型胶原蛋白，该重组人源III型胶原蛋白包括重复串联的单体，所述单体为突变的人源III型胶原蛋白氨基酸序列片段，单体的突变位点为人源III型胶原
蛋白氨基酸序列片段中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸的Gly‑X‑Y结构肽(三肽重复序列)。
[0010]优选的，所述单体为由50～500个氨基酸构成的肽段，突变的Gly‑X‑Y结构肽数与单体的Gly‑X‑Y结构肽总数的数量比为小于10％(例如，2％～8％)。
[0011]优选的，根据人源III型胶原蛋白氨基酸序列，选取该序列中第538至705位的168位氨基酸残基所组成的肽段，然后将该肽段中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸的Gly‑X‑Y结构肽作为突变位点进行优化，即将这些Gly‑X‑Y结构肽以使用频率较高且不含有上述氨基酸(缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸)的Gly‑X‑Y结构肽替换，并以优化后形成的168位氨基酸残基所组成的肽段作为重复串联表达的单体。[0012]优选的，所述单体的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1自氨基端起的第2
～169位。[0013]优选的，所述重组人源III型胶原蛋白中，单体的串联个数为2～10(例如，二重复串联单体、四重复串联单体、六重复串联单体)。
[0014]优选的，所述重组人源III型胶原蛋白的分子量为10KD～100KD。
[0015]一种重组人源III型胶原蛋白的表达系统，该表达系统包括表达重组人源III型胶原蛋白的菌株，该菌株是转化有重组人源胶原蛋白基因分泌型表达载体的野生型或突变型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，所述分泌型表达载体包括重组人源胶原蛋白基因表达盒，所述表达盒包括启动子(例如，醇氧化物酶启动子)、目的基因序列和终止区序列(例如，TT)，所述目的基因序列是由KEX2酶切位点、人源III型胶原蛋白氨基端(N端)第一个氨基酸的编码序列(甘氨酸的密码子，例如GGT)以及与该序列紧邻的用于对上述单体进行重复串联表达的多段重复编码序列(例如，二重复、四重复、六重复)和终止密码子(例如，TGATAA)组成的DNA序列。
[0016]优选的，所述单体的编码序列为SEQ.ID.NO.2自5’端起的第16～519位。
[0017]一种重组人源III型胶原蛋白的生产方法，包括以下步骤：
[0018]1)表达载体的构建：人工全基因合成如SEQ.ID.NO.2所示的DNA序列，该DNA序列在5’端添加有Xho I限制性内切酶酶切位点和KEX2酶切位点以及Xba I限制内切酶酶切位点，在3’端添加有Nhe I限制性
内切酶酶切位点和EcoR I限制性内切酶酶切位点(且二者之间用终止密码子间隔)；将SEQ.ID.NO.2所示的DNA序列连接至克隆载体(例如，pMD19‑T simple等T载体)中，得到单体基因的克隆载体(例如，T‑IIICOL质粒)；将单体基因的克隆载体进行Nhe I/EcoR I双酶切，并回收载体片段，另将单体基因的克隆载体进行Xba I/EcoR I双酶切，回收目的基因片段(含有单体的编码序列和终止密码子)，之后将回收的载体片段与目的基因片段进行连接、转化，获得含有二段重复的单体编码序列的克隆载体(例如，T‑IIICOL‑2质粒)，以此类推(即利用质粒酶切获得切除了终止密码子的载体片段和待增加的目的基因片段)，可获得不同的含有多段重复编码序列(例如，含有二段重复的单体编码序列、含有四段重复的单体编码序列、含有六段重复的单体编码序列)的克隆载体；将这些克隆载体分别利用Xho I/EcoR I进行双酶切，并将回收的含有不同重复数量的单体编码序列的目的基因序列(例如，二重复片段IIICOL‑2、四重复片段IIICOL‑4、六重复片段IIICOL‑6)，分别与毕赤酵母表达载体(例如，pPIC9K)骨架连接，即可获得不同重复单体数的串联表达载体(例如，pPIC9K‑IIICOL‑2质粒、pPIC9K‑IIICOL‑4质粒、pPIC9K‑IIICOL‑6质粒)；[0019]2)表达重组人源III型胶原蛋白的毕赤酵母基因工程菌的构建：将上述串联表达
载体转化毕赤酵母宿主菌(例如，GS115)后进行抗性筛选，并经摇瓶表达鉴定，获得表达不同分子量的重组人源III型胶原蛋白的基因工程菌，实现重组人源III型胶原蛋白高表达；[0020]3)重组人源III型胶原蛋白的发酵生产：对上述表达重组人源III型胶原蛋白的基因工程菌进行发酵，在发酵过程中通过添加甲醇诱导表达重组人源III型胶原蛋白。[0021]优选的，所述步骤3)中，以无机盐BSM培养基作为底料，使用
发酵罐进行发酵(pH4.5～6.0，温度25.0℃～30.0℃，溶氧控制在10％～50％)，甲醇诱导时间为40～50小时。
[0022]一种用于组织工程、美容产品的生物材料，该生物材料包括上述重组人源III型胶原蛋白。
[0023]本发明的有益效果体现在：
[0024]本发明将人源III型胶原蛋白天然序列中含有缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸的Gly‑X‑Y结构肽进行选择性突变(例如，以使用频率较高的不含上述氨基酸的Gly‑X‑Y结构肽替换)，通过构建用于串联表达不同重复片段数的优化序列的基因表达载体并转化毕赤酵母宿主菌，获得表达重组人源III型胶原蛋白的菌株，经发酵实验表明，所获得的重组人源III型胶原蛋白稳定性高，在发酵以及纯化和使用中几乎无降解，并且生物相容性好，有效的解决天然序列的重组人源III型胶原蛋白在发酵中发生降解的问题，可用于大规模生产重组人源III型胶原蛋白，且生产方法快速、简便。
[0025]进一步的，本发明可以通过构建表达不同重复片段数的毕赤酵母基因工程菌生产不同分子量的重组人源III型胶原蛋白，其中小分子量的重组人源III型胶原蛋白作为生物材料应用于化妆品等美容产品，大分子量的重组人源III型胶原蛋白作为生物材料应用于医疗器械。
附图说明
[0026]图1为天然人源III型胶原蛋白选定肽段(537‑705)的氨基酸序列示意图；图中竖线下方为替换后的氨基酸残基。
[0027]图2为具有不同重复串联单体数的重组人源III型胶原蛋白表达载体的构建流程图。
[0028]图3为具有不同重复串联单体数的重组人源III型胶原蛋白表达载体的质粒图谱。[0029]图4为毕赤酵母基因工程菌表达的重组人源III型胶原蛋白(优化序列)的电泳图，其中：泳道1为二重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌表达产物，泳道2为四重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌表达产物，泳道3为六重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌表达产物，泳道4为蛋白Marker。
[0030]图5为毕赤酵母基因工程菌表达的重组人源III型胶原蛋白(天然序列)的电泳图，其中：泳道M为蛋白Marker，泳道1为六重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌表达产物，泳道2为四重复重组人源III型胶原蛋白基因工程菌表达产物，泳道3为二重复重组人源III 型胶原蛋白基因工程菌表达产物。
[0031]图6为不同基因工程菌发酵液上清电泳图，其中：泳道1为六重复重组人源III型胶原蛋白(优化序列)基因工程菌发酵液上清，泳道M为蛋白Marker，泳道2为六重复重组人源III型胶原蛋白(天然序列)基因工程菌发酵液上清。
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