(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711340835.1
(22)申请日 2017.12.14
(71)申请人 华中科技大学
地址 430074 湖北省武汉市洪山区珞喻路
1037号
(72)发明人 闫云君 焦梁成 周清华 宿智新
乔阳歌 杨凯欣
(74)专利代理机构 华中科技大学专利中心
42201
代理人 许恒恒 李智
(51)Int.Cl.
C12N 15/81(2006.01)
C12N 15/66(2006.01)
(54)发明名称
构建方法与运用
(57)摘要
本发明公开了毕赤酵母基因敲除和抗性基
因回收载体及构建方法与运用，属于微生物基因
工程领域。本发明毕赤酵母基因敲除的模板载体
包括毕赤酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基
因表达盒以及两端的lox71和lox66特异性重组
酶识别位点和博来霉素抗性基因表达盒；本发明
毕赤酵母基因抗性基因回收载体包括利用毕赤
酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基因表达盒、
利用GAP启动子组成型表达的cre基因表达盒和
HygB抗性基因表达盒。本发明极大地提高了毕赤
酵母基因的敲除效率。本发明提供了基因敲除后
抗生素标记回收的方法，为多基因的高效敲除提
供了极大的便利，且敲除的效率高，使用的同源
臂短。权利要求书3页 说明书10页序列表5页 附图4页CN 108004264 A 2018.05.08
C N 108004264
A
1.一种毕赤酵母基因敲除的模板载体pAOXZ-mazf，其特征在于，该模板载体包括毕赤酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基因表达盒和博来霉素抗性基因表达盒；
所述mazf表达盒的5’端含有用于插入待敲除基因下游同源片段的酶切位点A，该酶切位点的5’端含有Cre特异性重组系统识别的lox66位点；
所述mazf表达盒的3’端含有用于插入待敲除基因上游同源片段的酶切位点B，该酶切位点的3’端含有Cre特异性重组系统识别的lox71位点；
所述博来霉素抗性基因表达盒位于所述lox66位点的5’端与所述lox71位点的3’端之间；
所述酶切位点A和酶切位点B为不同的酶切位点，且酶切位点A和酶切位点B在所述模板载体上唯一存在。
2.一种毕赤酵母基因敲除的模板载体pAOXZ-mazf的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在大肠杆菌中扩增得到mazf基因，在mazf基因的两端引入酶切位点；
(2)将步骤(1)得到的引入了酶切位点的mazf基因酶切后，得到暴露出粘性末端的mazf 基因；将载体pPICZA经过酶切后，得到暴露出与mazf基因相同粘性末端的pPICZA载体；将所述暴露出粘性末端的mazf基因与暴露出相同粘性末端的pPICZA载体进行混合连接，将该连接了mazf基因的pPICZA载体转化大肠杆菌感受态细胞，经含有博来霉素的平板筛选后，随机挑选长出的克隆子抽质粒酶切验证后，经测序验证后命名为pPICZA-mazf；
(3)以步骤(2)得到的pPICZA-mazf为模板，使用引物lox66-F和lox71-R1第一轮PCR扩增得到含有lox 66位点和mazf表达盒的片段，将该片段作为第二轮PCR的模板，使用引物lox66-F和lox71-R2通过第二轮PCR扩增得到两端分别含有lox66和lox71位点的mazf表达盒片段；
(4)将步骤(3)得到的片段酶切后纯化回收，然后与pPICZA-mazf载体酶切后纯化回收含有抗生素基因部分的片段连接后，转化大肠杆菌感受态细胞，经含有博来霉素的平板筛选，随机挑选长出的克隆子抽质粒酶切验证后，经测序验证后命名为pAOXZ-mazf。
3.如权利要求2所述的毕赤酵母基因敲除的模板载体pAOXZ-mazf的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述
的酶切位点是EcoR I和Sal I酶切位点；步骤(4)所述将步骤(3)得到的片段酶切是采用BamH I单酶切；步骤(4)所述pPICZA-mazf载体酶切是Bgl II和BamH I双酶切。
4.如权利要求1所述毕赤酵母基因敲除的模板载体用于敲除毕赤酵母基因的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)目的基因敲除载体的构建：根据待敲除的基因序列的下游序列设计整合同源臂，根据待敲除的基因序列的上游序列设计敲除同源臂；所述整合同源臂作为同源片段将敲除载体整合入毕赤酵母基因组；所述敲除同源臂用于基因敲除过程中mazf基因表达盒丢失的同源片段；将所述整合同源臂和敲除同源臂分别插入权利要求1所述的pAOXZ-mazf载体的酶切位点A和B处，其中，整合同源臂的5’端为lox66位点，敲除同源臂的3’端为lox71位点，构成目的基因敲除载体；所述整合同源臂含有至少一个所述目的基因敲除载体上唯一存在的酶切位点；
(2)目的基因敲除载体整合入毕赤酵母基因组：将步骤(1)所述目的基因敲除载体在整
合同源臂片段处线性化回收，转入毕赤酵母菌株感受态细胞，在含有博来霉素抗性平板涂布筛选，得到的克隆子进一步经过基因组PCR验证确认所述目的基因敲除质粒整合入目的基因下游位点处；
(3)将步骤(2)中确认正确的克隆子接种于含有博来霉素抗性的甲醇诱导液体培养基中培养到菌体浑浊，再
将菌体划线接种于毕赤酵母生长培养基平板分离得到单菌落，对分离得到的单菌落进行PCR验证，得到已完成目的基因敲除的毕赤酵母；
优选地，步骤(3)所述的毕赤酵母生长培养基平板为含有博来霉素抗性的平板。
6.一种毕赤酵母基因抗性基因回收载体pHGAPCre-mazf，其特征在于，该回收载体包括：利用毕赤酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基因表达盒AOX1-mazf-AOX1TT、利用GAP启动子组成型表达的Cre基因表达盒GAP-Cre-AOX1TT和HygB抗性基因表达盒TEF1-HygB-CYC TT；所述mazf基因表达盒和Cre基因表达盒在所述pHGAPCre-mazf回收载体上方向相反；所述GAP启动子处含有至少一个在所述pHGAPCre-mazf回收载体唯一存在的酶切位点。
7.一种毕赤酵母基因抗性基因回收载体pHGAPCre-mazf的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将HygB片段、TEF1启动子片段和CYC TT片段经过重叠延伸PCR融合连接得到TEF1-HygB-CYC TT表达盒，将该TEF1-HygB-CYC TT表达盒和pGAPZαA载体酶切纯化后连接得到以潮霉素B作为筛选标记的毕赤酵母表达载体pGAPHαA；
(2)将Cre基因片段与步骤(1)得到的pGAPHαA载体经过酶切后回收纯化得到的载体片段通过重组连接得到表达载体pHGAP-Cre；
(3)将权利要求2所述的pPICZ-mazf载体通过酶切纯化后得到含有AOX1-mazf-AOX1TT 表达盒后插入步骤(2)得到的pHGAP-Cre载体后，筛选AOX1-mazf-AOX1TT表达盒与GAP-Cre-AOX1TT表达盒反向连接的载体得到pHGAPCre-mazf。
8.如权利要求7所述的毕赤酵母基因抗性基因回收载体pHGAPCre-mazf的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述的酶切是BamH I和Mlu I双酶切；步骤(2)所述的酶切是Asu II和Not I双酶切；步骤(2)所述的酶切是BamH I和Bgl II双酶切。
9.如权利要求6所述毕赤酵母基因抗性基因回收载体pHGAPCre-mazf在回收毕赤酵母基因抗性基因方面的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求书6所述的毕赤酵母基因抗性基因回收载体pHGAPCre-mazf整合入毕赤酵母基因组；将pHGAPCre-mazf在GAP启动子位点处线性化回收后，转入权利要求5中所述已完成目的基因敲除的毕赤酵母感受态细胞，在含有潮霉素B抗生素的平板涂布筛选，得到的克隆子进一步经过基因组PCR验证，确认pHGAPCre-mazf在GAP启动子位点处插入已完成目的基因敲除的毕赤酵母基因组；
(2)博来霉素抗性基因的回收：将步骤(1)得到的转入pHGAPCre-mazf载体的毕赤酵母分别接种于含有和
不含有博来霉素的抗性平板进行抗性平板验证，对不具有博来霉素抗性的克隆子进一步通过基因组PCR验证确认组成型表达的Cre重组酶已实现lox71和lox66位点之间的重组剪接；
(3)抗性基因回收载体pHGAPCre-mazf的回收：将步骤(2)确认组成型表达的Cre重组酶已实现lox71和lox66位点之间的重组剪接的克隆子接种于甲醇诱导液体培养基中培养到
菌体浑浊，再将菌体划线接种于毕赤酵母生长培养基平板，对分离得到的单菌落分别接种于含有和不含有潮霉素B的抗性平板进行验证HygB抗性，对不具有HygB抗性的克隆子进一步通过基因组PCR验证所述pHGAPCre-mazf载体实现完全回收，即得到无抗性敲除的毕赤酵母菌株。
毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体及构建方法与运用
技术领域
[0001]本发明属于基因工程领域，更具体地，涉及一种毕赤酵母基因敲除的方法。背景技术
[0002]毕赤酵母(Pichia pastoris)是一类能以甲醇作为唯一碳源和能量来源进行生长的甲醇营养型酵母。毕赤酵母含有醇氧化酶AOX1强启动子，这是目前调控机理最严格的启动子之一，在甲醇为唯一碳源时，基因的表达可受甲醇严格调控。毕赤酵母表达系统因其生长速度快、易于基因遗传转化操作、有多种强启动子可选择、表达效率高、可实现高密度发酵等优点而被广泛应用于各种外源蛋白质的表达，并
获得了较高的蛋白表达水平。
[0003]毕赤酵母体内无天然质粒存在，一般将载体整合入基因组内以形成稳定遗传的转化子。为了实现外源蛋白的高效表达或揭示某些未知基因的功能，往往需要对宿主进行一系列的遗传操作以实现相应的生物学目的。其中，基因敲除作为一种常用的技术手段，被广泛的应用于毕赤酵母的研究。
[0004]普遍使用的基因敲除手段是通过同源重组双交换方式实现基因的插入失活或基因删除。在传统的酿酒酵母中进行基因敲除，往往只需要50bp左右的同源臂就能实现有效的基因敲除。然而，在一些非传统酵母如毕赤酵母中，由于非同源末端连接修复机制导致基因敲除过程中双交换事件发生的概率降低，为了实现相对高效的敲除，一般使用长度大于1000bp的同源臂，对于某些基因的敲除甚至需要超过2000bp的同源臂，尽管能够实现敲除的目的，但敲除的成功率仍然相对较低。
[0005]目前，实现无抗性基因残留的遗传操作主要采取的是抗生素基因回收策略。主要包括基于位点特异性重组法(如Cre -loxp、Flp -Frt等重组系统)和利用自杀基因作为反筛选标记剔除法(如ura3基因在URA3营养缺陷型酵母作为自杀基因、大肠杆菌毒素蛋白MazF 等)。然而利用URA3反向筛选标记，需要使用尿嘧啶缺陷型菌株，极大地限制了其应用范围。
[0006]目前，主要有以下几种方法应用于提高毕赤酵母基因敲除的效率。(1)通过增加同源臂的长度，提高同源重组双交换发生的概率；(2)敲除毕赤酵母中ku70基因，通过破坏其非同源重组末端连接途径，使
得酵母内的基因修复主要通过同源重组途径，从而提高敲除效率。然而非同源重组作为毕赤酵母体内重要的基因修复途径之一，其功能的缺陷可能会造成宿主的稳定性降低或其他不可预知的缺陷；(3)通过构建辅助载体预先表达待敲除基因，通过增加基因的冗余弥补基因敲除后可能导致的生长缺陷实现基因的高效敲除。
[0007]尽管结合上述各种方法能实现毕赤酵母基因的敲除，然而毕赤酵母基因敲除的成功率仍然偏低，某些难敲除基因(比如α-1,6-甘露糖转移酶基因och1等)的敲除往往需要筛选大量的克隆子而导致敲除过程十分困难，甚至得不到敲除成功的克隆子；或者在实现提高敲除效率的同时，残留了标记基因，无法实现标记基因的重复利用，同时，多种筛选标记的残存往往会留下潜在的遗传风险。
[0008]因此，构建一种高效毕赤酵母基因敲除方法的同时实现敲除后标记基因的回收，具有重要的应用价值。
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