(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.06.04
C N 103842823
A (21)申请号 201280045049.8
(22)申请日 2012.09.14
2011-202463 2011.09.15 JP
G01N 33/574(2006.01)C07K 14/47(2006.01)C07K 16/18(2006.01)C12N 15/09(2006.01)
(71)申请人国立大学法人名古屋大学
地址日本爱知县
申请人株式会社医学生物学研究所
株式会社昂考米克斯
(72)发明人柳泽圣 高桥隆 横井香平
长谷川好规 小野健一郎八木香澄 增田瞳 竹内俊幸(74)专利代理机构北京市中咨律师事务所 11247代理人曽祯
段承恩(54)发明名称
物及其表达分析方法
(57)摘要
本发明的课题是开发简便且廉价、可信度高
的间皮瘤的检查方法、和该检查方法中使用的试
剂盒。作为解决问题的方法是，本发明提供间皮瘤
的检查方法，包括受试者的血液和胸水中的至少
步骤。有时所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定
步骤使用针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。本发明
膜蛋白蛋白质的抗体。在本发明的用于间皮瘤的
诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的诊断是判断
可能患间皮瘤的受试者是间皮瘤的患者还是健常
者。本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时
所述间皮瘤的诊断是判断可能患间皮瘤的受试者
是间皮瘤的患者还是除了间皮瘤以外的呼吸器官
疾患的患者。(30)优先权数据
(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2014.03.14
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/JP2012/005878 2012.09.14
(87)PCT国际申请的公布数据
WO2013/038696 JA 2013.03.21
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书18页序列表12页 附图5页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书18页序列表12页 附图5页(10)申请公布号CN 103842823 A
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1.间皮瘤的检查方法，其特征在于，包括受试者的血液和胸水中的至少任1种样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤。
2.根据权利要求1所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤使用针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。
3.根据权利要求1或2所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体，是与包含序列号2所记载的氨基酸序列的多肽结合的抗体。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤，使用能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体。
5.根据权利要求4所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述间皮瘤是恶性胸膜间皮瘤。
6.根据权利要求4所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述间皮瘤是肉瘤型或双相型的恶性胸膜间皮瘤。
7.根据权利要求1～6的任一项所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述血液样品是受试者的血浆或血清的样品。
8.用于间皮瘤的诊断的试剂盒，其特征在于，包含针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。
9.根据权利要求8所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，其特征在于，所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体，是与包含序列号2所记载的氨基酸序列的多肽结合的抗体。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体，是能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体。
11.根据权利要求10所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，其特征在于，包含：固定化了能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体中的一种的固体支持体、和针对所述2种抗体中的另一种的特异性结合配偶体。
12.根据权利要求8～11的任一项所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，所述间皮瘤的诊断，是判断可能患间皮瘤的受试者是否是间皮瘤的患者。
13.根据权利要求8～11的任一项所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，所述间皮瘤的诊断，是判断可能患间皮瘤的受试者是间皮瘤的患者还是除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者。
14.根据权利要求12或13所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，其特征在于，所述间皮瘤的患者是恶性胸膜间皮瘤的患者。
15.根据权利要求14所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，其特征在于，所述间皮瘤的患者是肉瘤型或双相型的恶性胸膜间皮瘤的患者。权 利 要 求 书CN 103842823 A
用于胸膜间皮瘤患者的早期发现的分子标志物及其表达分
析方法
技术领域
[0001] 本发明涉及间皮瘤的检查方法、和用于间皮瘤的诊断的试剂盒。具体地，涉及包含血液和胸水中的至少任1种样品中的人骨膜蛋白(Periostin)的浓度的测定步骤的间皮瘤的检查方法、和包含针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体的用于间皮瘤的诊断的试剂盒。
背景技术
[0002] 已知间皮瘤由于石棉的吸引而发生。间皮瘤根据发生部位而分类为胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤和心膜间皮瘤。胸膜中的发生最多，占全部间皮瘤的8成～9成(非专利文献1)。良性的胸膜间皮瘤称为纤维性间皮瘤，在肺炎、外伤等之后，胸膜发生纤维增生，结果形成局限性的肿块；与此相对，恶性胸膜间皮瘤是由胸膜间皮(覆盖包裹肺的胸膜的肺侧表面的二重的膜)发生的肿瘤，是恶性度高的肿瘤。恶性胸膜间皮瘤进行组合了外科疗法、内科疗法和放射线疗法的，但仍属于预后差的肿瘤之一。间皮瘤具有
潜伏期非常长的特征，从向石棉的曝露到间皮瘤发生的时间为11～54年(中位数38.6年)。鉴于日本石棉使用最多的时期为1970～1990年，预计到2030年为止间皮瘤患者持续增加。该长的潜伏期连同没有对早期发现有用的筛选法的现状，造成了发病发现的延迟。晚期例的经过极不良，快速扩散、数年以内死亡的病例为大半。然而，对于可以治愈切除的早期发现例，却可以期待长期生存。因此，能够早期发现的新的筛选检查的开发成为迫切的课题。
[0003] 恶性胸膜间皮瘤的早期诊断极困难，当因为胸痛、胸积水造成的呼吸困难等自觉症状而发现时，基本上已经是晚期。作为在诊断恶性胸膜间皮瘤时有用的标志物，可列举胸水中的透明质酸、CYFRA、CEA等，但具有作为样品必须采集胸水、诊断精度低等大的问题。进而，为了进行确实的诊断，必须使用活检材料进行真正的病理组织诊断，精神、肉体、社会的负担极大。另外，恶性胸膜间皮瘤作为组织型分为上皮型、肉瘤型、其混合型(双相型)，但特别是肉瘤型没有有效的诊断方法，预后劣恶。因此，多数情况下诊断为恶性间皮瘤诊断时，已经大范围扩散、不可能进行根治手术，预后极不良，1年生存率为50％左右，2年生存率为20％左右。
[0004] 由于石棉曝露而非肿瘤性炎症性的障害在肺、胸膜内发生，因此石棉曝露者在间皮瘤未发病的阶段已经发现医学影像学异常。因此，认为医学影像学检查作为筛选有用性低。另外相对于曝露者的数，实际发病的病例的比例小。现状是渴望对于石棉曝露者简便且廉价、可信度高的检查方法。
[0005] 首先，本发明者们着眼于作为血中的肿瘤标志物的间皮素(mesothelin)阳性例限于上皮型的间皮瘤，尝试探索对于肉瘤型的胸膜间皮瘤例也能确认阳性例的标志物。肉瘤型胸膜间皮瘤的诊断被倡导必须进行细胞诊断、胸膜活检、图像诊断，诊断极困难(非专利文献2)。本发明者们经由利用了质谱装置的IDA(信息相关采集，Information Dependent Analysis)、运用了数据库的生物信息学分析、使用了DNA微阵列的与基因表达的比较、利用基序(motif)检索的蛋白质功能预测、利用与内标资料的比较的定量化等工序，通过应
用蛋白质组分析结果的挖掘技术来分析胸膜间皮瘤组织样品中的蛋白质表达谱，尝试获得数百种蛋白质的表达信息，并成功地获得。
[0006] 进而为了进行作为血液中的标志物的候选缩小研究，进行了以血液为对象的蛋白质组学分析：利用了质谱装置的MRM(多反应监测，Multiple Reaction Monitoring)。并且，对于所述数百种蛋白质中的特别数十种蛋白质，与作为对照的正常胸膜间皮组织样品比较，确认了在恶性胸膜间皮瘤组织样品中其存在量增大。进而，在恶性胸膜间皮瘤病例血液样品中，与作为对照的除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患病例比较，确认了骨膜蛋白(Periostin)的浓度上升。
[0007] 骨膜蛋白最初称为成骨细胞特异性因子-2(OSF-2)，是作为在小鼠成骨细胞株MC3T3-E1细胞中特异地表达的基因而被分离鉴定的分子(非专利文献3)。由骨膜蛋白基因所编码的氨基酸序列包含一般的信
号序列、富含半胱氨酸的结构域(Cysteine-rich Domain)、4次重复的由约150个氨基酸组成的成束蛋白(Fasciclin)1结构域、和羧基末端结构域。骨膜蛋白中存在4种仅羧基末端区不同的剪接突变体的同种型。有骨膜蛋白不是在肺癌的肿瘤细胞本身、而是在肿瘤周围的间质细胞中高表达的报告(非专利文献4、5)；血清中的骨膜蛋白虽然没有发现在非小细胞性肺癌存在诊断中的有用性，但有可能成为预后的标志物的报告(非专利文献4、5)；在乳癌中高表达的报告(非专利文献6)；在胸腺癌中高表达的报告(非专利文献7)；在胰癌中高表达的报告(非专利文献8)。但是这些癌是与间皮瘤完全不同的病状。进而，有公开了识别骨膜蛋白的形成剪接突变体的羧基末端结构域的第17外显子的氨基酸的抗体在心疾患和其他癌种的诊断和中有效的专利申请(专利文献1、2)。但是，关于骨膜蛋白的表达和在血中的存在、与间皮瘤的关系到目前为止未知。
[0008] 现有技术文献
[0009] 专利文献
[0010] 专利文献1：国际公开第WO2007/077934号小册子
[0011] 专利文献2：国际公开第WO2009/001940号小册子
[0012] 非专利文献
[0013] 非专利文献1:Fujimoto N.等、J Cancer Res Clin Oncol.、136：1755、2010 [0014] 非专利文献2:Husain等、Arch.Pathol.Lab.Med.、133：1317、2009
[0015] 非专利文献3:Takeshita S.等、Biochem J、294：271、1993
[0016] 非专利文献4:Sasaki H.等、Jpn J Cancer Res.、92：869、2001
[0017] 非专利文献5:Sasaki H.等、Cancer.、92：843、2001
[0018] 非专利文献6:Shao R.等、Mol Cell Biol.、24：3992、2004
[0019] 非专利文献7:Sasaki H.等、Cancer Lett.、72：37、2001
[0020] 非专利文献8:Baril P.等、Oncogene、26：2082、2007
发明内容
[0021] 发明要解决的课题
[0022] 需要开发简便且廉价、可信度高的间皮瘤的检查方法，和该检查方法中使用的试剂盒。
[0023] 用于解决课题的方法
[0024] 本发明提供间皮瘤的检查方法，包括受试者的血液和胸水中的至少任1种样品中的人骨膜蛋白(Periostin)蛋白质的浓度的测定步骤。
[0025] 本发明的间皮瘤的检查方法中，有时所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤使用针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。
[0026] 本发明的间皮瘤的检查方法中，有时所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体是与包含序列号2所记载的氨基酸序列的多肽结合的抗体。
[0027] 本发明的间皮瘤的检查方法中，有时使用能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体。
[0028] 本发明的间皮瘤的检查方法中，有时所述间皮瘤是恶性胸膜间皮瘤。
[0029] 本发明的间皮瘤的检查方法中，有时所述间皮瘤是肉瘤型或双相型的恶性胸膜间皮瘤。
[0030] 本发明的间皮瘤的检查方法中，有时所述血液样品是受试者的血浆或血清的样品。
[0031] 本发明提供用于间皮瘤的诊断的试剂盒，包含针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。[0032] 本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体是与包含序列号2所记载的氨基酸序列的多肽结合的抗体。有时所述试剂盒通过ELISA法来测定人骨膜蛋白蛋白质的浓度。
[0033] 本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体是能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体。
[0034] 本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时包含固定化了能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体中的一种的固体支持体、和针对所述2种抗体中的另一种的特异性结合配偶体(partner)。有时所述试剂盒通过夹心ELISA法来测定人骨膜蛋白蛋白质的浓度。
[0035] 本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的诊断是判断可能患间皮瘤的受试者是否是间皮瘤的患者。
[0036] 本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的诊断是判断可能患间皮瘤的受试者是间皮瘤的患者还是除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者。
[0037] 本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的患者是恶性胸膜间皮瘤的患者。
[0038] 本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的患者是肉瘤型或双相型的恶性胸膜间皮瘤的患者。
[0039] 本发明提供间皮瘤的诊断方法，包括受试者的血液和胸水中的至少任1种样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤。
[0040] 本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤使用针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。
[0041] 本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体是与包含序列号2所记载的氨基酸序列的多肽结合的抗体。
[0042] 本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤使
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