[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101554388A [43]公开日2009年10月14日
[21]申请号200910051876.8[22]申请日2009.05.22
[21]申请号200910051876.8
[71]申请人复旦大学附属肿瘤医院
地址200032上海市零陵路399号
[72]发明人朱晓燕 刘鲁明 孟志强 陈震 俞培忠
葛勇前 [74]专利代理机构上海正旦专利代理有限公司代理人吴桂琴
[51]Int.CI.A61K 35/56 (2006.01)A61P 35/00 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 5 页
[54]发明名称
的用途
[57]摘要
本发明属中药制药领域，涉及华蟾素注射液有
效组份及其在制备抗肿瘤药物中的新用途。本发明
采用大孔吸附树脂分离华蟾素注射液中的有效组份，
分别用水、50％乙醇洗脱HP－20大孔树脂分离得到
析、鉴别，制得蟾素注射液中含有亲脂性的蟾毒内
酯类物质的非极性组份，含有水溶性的生物碱类物
质的极性组份。所述的华蟾素注射液有效组份内外
抑瘤实验证实，能抑制SW1990细胞生长，对荷人胰 腺癌SW1990裸小鼠的肿瘤生长有明显的抑制作用， 可进一步制备抗人胰腺癌药物，尤其制备含华蟾素
注射液中的非极性组份的抗人胰腺癌药物。
200910051876.8权 利 要 求 书第1/1页 1、华蟾素注射液有效组份在制备抗肿瘤药物中的用途，其中所述的有效组份包括非极性组份和极性组份，所述的非极性组份含有亲脂性的蟾毒内酯类物质；极性组份含有水溶性的生物碱类物质。
2、权利要求1的用途，其特征是所述的华蟾素注射液有效组份通过下述方法制备：
采用大孔吸附树脂分离华蟾素注射液中的有效组份，分别用水、50％乙醇洗脱HP-20大孔树脂分离得到
不同极性组份，用薄层谱法和高效液相谱法分析、鉴别，制得蟾素注射液中含有亲脂性的蟾毒内酯类物质的非极性组份，含有水溶性的生物碱类物质的极性组份。
3、权利要求1的华蟾素注射液有效组份在制备抗人胰腺癌药物中的用途。
4、按权利要求3的用途，其特征是所述的华蟾素注射液有效组份其抑制肿瘤作用随剂量增加而增强。
5、按权利要求3的用途，其特征是所述的华蟾素注射液有效组份其中非极性组份和极性组份联合应用。
6、一种抗人胰腺癌药物组合物，其特征是含有华蟾素注射液中的非极性组份。
200910051876.8说 明 书第1/10页华蟾素注射液有效组份及其在制备抗肿瘤药物中的用途
技术领域
本发明属中药制药领域，涉及华蟾素注射液有效组份及其在制备抗肿瘤药物中的新用途。
背景技术
华蟾素注射液(Huchansu injection)是中华大蟾蜍皮(Bufo gargarizans cantor 或黑眶蟾蜍(B.melanosticutus schneider)经加工制成的水溶性制剂，是我国临床应用较广的抗肿瘤中药制剂，对原
发性肝癌、肺癌、食管癌和胃癌具有较好的疗效(左小东，崔永安，秦叔逵等.临床肿瘤学杂志，2003，8(3)：232-235)。现有技术公开了，华蟾素对人胃腺癌MGC-80-3细胞、白血病U937细胞生长有明显抑制作用，其IC50分别约为0.16ug/ml、1.36ug/ml；华蟾素在一定剂量下对乳腺癌细胞MCF-7细胞、人白血病N B4细胞的生长具有明显的抑制作用(左小东，崔永安，王锦鸿等.临床肿瘤学杂志，2003，8(1)：33-37；.汪少娟，曾叶，杨业金.现代中西医结合杂志，2006，05：572-574，642；王焰，李军民，杨晨敏等.肿瘤，2005，6：534-537)，还能明显抑制白血病细胞株Jurkat细胞、K562细胞生长，并随浓度增加及用药时间延长抑制率提高(王焰，李军民，张莉等.诊断学理论与实践，2005，4：308-312；盛秀胜，徐玲娟.实用肿瘤杂志，2007，1：32-35)；体内实验表明，华蟾素对肝肿瘤H22移植瘤小鼠抑制率为30.99％，明显高于荷瘤模型组(P＜0.01)。华蟾素高、中、低不同剂量(12.5、10.0、8.0g/kg)对Lewis肺癌小鼠瘤体生长均有抑制作用。由此，华蟾素能抑制多种肿瘤细胞的生长，并具有量效关系。目前尚未见有关华蟾素对胰腺癌抑瘤作用的报道。
与本发明有关的参考文献还有：
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发明内容
本发明的目的是提供华蟾素注射液有效组份及其在制备抗肿瘤药物中的新用途。尤其涉及华蟾素注射液有效组份在制备抗人胰腺癌药物中的新用途。
本发明的华蟾素注射液有效组份包括非极性组份，其中含有亲脂性的蟾毒内酯类物质；和极性组份，其中含有水溶性的生物碱类物质，主要为吲哚类生物碱。 所述的华蟾素注射液有效组份通过下述方法制备：
采用大孔吸附树脂(M a c r o p o r o u s A d s o r p t i o n R e s i n)技术分离华蟾素注射液中的有效组份，并用薄层谱法(Thin Layer Chromatography，TLC)和高效液相谱分析法(high performance liquid chromatography，HPLC)进行初步鉴别。分别用水、
50％乙醇洗脱HP-20大孔树脂分离得到不同极性组份，然后采用薄层谱法和高效液相谱法对两者进
行分析。结果显示：华蟾素注射液非极性、极性组份的提取率分别为0.125％，0.3625％。薄层谱检测结果显示，极性组份用Dragendoff显剂喷洒有斑点呈桔红，推断为生物碱类物质；非极性组份喷洒20％乙酸-硫酸溶液有紫斑点出现，推断为甾体强心甙类物质。高效液相谱仪紫外光谱扫描显示，非极性组份在40min以后有紫外吸收峰，其中以47min、51min和53min出现的吸收峰明显；极性组份在10min 以前有明显的紫外吸收峰，且与华蟾素注射液相应位置出现的紫外吸收峰相似。表明所制得的蟾素注射液中非极性组份中含有亲脂性的蟾毒内酯类物质，而极性组份中含有水溶性的生物碱类物质。
本发明采用华蟾素注射液中不同组份对人胰腺癌S W1990进行了体内外抑瘤作用的实验观察。
结果显示，华蟾素的非极性组分(主要为蟾毒内酯类物质)，其抑制胰腺癌细胞生长的作用远大于极性组分(主要为吲哚类生物碱)。
本发明采用华蟾素不同组份药液作用于96孔板中，用W S T-8法测定其对人胰腺癌细胞S W1990的生长抑制作用；将荷人胰腺癌S W1990裸小鼠随机分为生理盐水、华蟾素(25g/k g)、华蟾素非极性组份、华蟾素极性组份和华蟾素联合组份(非极性+极性组份)组，定期测量各组小鼠的肿瘤大小，并于4周后计算抑瘤率。 结果显示，
1)体外实验：华蟾素、非极性组份、联合组份对S W1990细胞均有抑制生长作用，华蟾素作用72h的I C50为0.52±0.44m g/m l，非极性组份为31.85±10.72u g/m l，联合组份为99.11±89.02ug/ml；
2)体内实验：华蟾素25g/k g剂量组对荷人胰腺癌细胞株S W1990裸小鼠有较好的抑瘤作用，用华蟾素25g/k g等剂量的非极性组份、极性组份和联合组份处理后的荷人胰腺癌S W1990裸小鼠的瘤重明显减轻，非极性组抑瘤率为58.39％，极性组为55.38％，联合组份为62.97％，抑瘤率均明显优于生理盐水对照组(p＜0.01，p＜0.05，p＜0.01)，而各组份之间未见到显著性差异(p＞0.05)。
结果表明，所述的非极性组份、极性组份、联合组份对荷人胰腺癌S W1990裸小鼠的肿瘤生长均有明显的抑制作用，其中联合组份作用更强；非极性组份为华蟾素抗胰
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