(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910218663.3
(22)申请日 2019.03.21
(71)申请人 周口师范学院
地址 466001 河南省周口市川汇区文昌路
东段周口师范学院
(72)发明人 王健 刘坤 唐跃辉 齐静
徐克东
(74)专利代理机构 西安铭泽知识产权代理事务
所(普通合伙) 61223
代理人 俞晓明
(51)Int.Cl.
A01N 43/90(2006.01)
C07D 473/34(2006.01)
A01P 21/00(2006.01)
(54)发明名称一种细胞分裂素的制备方法(57)摘要本发明属于细胞分裂素提取技术领域，特别涉及一种细胞分裂素的制备方法。包括如下步骤：S1、用提取液浸提植物的根或茎的粉末，得到浸提液；S2、将浸提液离心，收集上清液，同时将残渣继续浸提，离心，将两次上清液合并，得到离心液；S3、将离心液过固相萃取柱，收集滤液后，减压蒸馏至无溶剂蒸出为止，得到浓缩物；S4、将浓缩物与聚乙烯吡咯烷酮混合，分液后，取上清液；S5、上清液过硅胶柱，洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯，进行梯度洗脱，设定等体积为一个馏分收集，检测并合并相同斑点的馏分后，减压蒸馏，干燥得到玉米素。本发明的纯化方法操作简单，成本低。此外纯化方法中的玉米素的收率高，纯 度高达97％。权利要求书1页 说明书5页CN 109832288 A 2019.06.04
C N 109832288
A
1.一种细胞分裂素的制备方法，所述细胞分裂素为玉米素，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取植物的根或茎，用液氮冷冻后，研磨成粉末，再向粉末中加入提取液，-25℃～-20℃下浸提10h～12h，得到浸提液；
所述提取液为甲醇的水溶液，所述甲醇的水溶液中甲醇与水的体积比为4:1；
S2、将浸提液在10000r/min～15000r/min，4℃下离心8min～12min，收集上清液置于离心管并保存于-25℃～-20℃下，残渣再用提取液于-25℃～-20℃提取5h～8h，离心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得离心液；
S3、将上述离心液过固相萃取柱，收集滤液后，减压蒸馏至无溶剂蒸出为止，得到浓缩物；
S4、将浓缩物与聚乙烯吡咯烷酮混合，分液后，取上清液；
S5、上清液过硅胶柱，洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯，进行梯度洗脱，设定等体积为一个馏分收集，检测并合并相同斑点的馏分后，减压蒸馏，干燥得到玉米素。
2.如权利要去1所述的细胞分裂素的制备方法，其特征在于，S1中所述植物的根或茎的质量与所述提取液的体积比为0.5g/mL～1.2g/mL。
3.如权利要去1所述的细胞分裂素的制备方法，其特征在于，所述S3的具体步骤为：用1ml甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡C18固相萃取柱，然后将离心液通过置于真空抽滤装置上的C18固相萃取柱，并连接上真空泵，以1ml/min的速度抽滤，收集滤液。
4.如权利要去1所述的细胞分裂素的制备方法，其特征在于，S4中每1mL聚乙烯吡咯烷酮中溶解0.05g浓缩物。
5.如权利要去1所述的细胞分裂素的制备方法，其特征在于，S5上清液过硅胶柱为称取200目～300目细硅胶装入到玻璃柱中，使硅胶自由沉降，将S4中的上清液上样到细硅胶柱中；
且按照二氯甲烷：乙酸乙酯的体积比为13:1；9:1；7:1；6:1；2:1进行梯度洗脱。
6.如权利要去1所述的细胞分裂素的制备方法，其特征在于，S5中设定为15mL为一个馏分收集。
7.如权利要去1所述的细胞分裂素的制备方法，其特征在于，S5中的斑点为采用薄层层析谱检测后得到的斑点。
权 利 要 求 书1/1页CN 109832288 A
一种细胞分裂素的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于细胞分裂素提取技术领域，特别涉及一种细胞分裂素的制备方法。
背景技术
[0002]细胞分裂素(cytokinin)活性物质包括两类：一是嘌呤型的细胞分裂素(CTK)，其结构均为腺嘌呤在
N6位置上取代衍生物，如玉米素(ZT)、激动素(KT)等；另一类是苯基脲型的衍生物类细胞分裂素，如N，N'-二苯基脲(DPU)等。天然的细胞分裂素存在于茎尖、根尖、未成熟的种子、萌发中的种子和生长的果实中，其作用是促进细胞分裂，细胞体扩大，使芽分化，解除顶端优势，促进侧芽生长，抑制衰老等，对种子和芽有打破休眠、促使萌发的作用。
发明内容
[0003]本发明的目的在于，提供一种从植物根茎中提取玉米素的方法。
[0004]为了实现上述目的，本申请采用的技术方案为：
[0005]一种细胞分裂素的制备方法，所述细胞分裂素为玉米素，包括如下步骤：[0006]S1、取植物的根或茎，用液氮冷冻后，研磨成粉末，再向粉末中加入提取液，-25℃～-20℃下浸提10h～12h，得到浸提液；
[0007]所述提取液为甲醇溶液，所述甲醇溶液中甲醇与水的体积比为4:1；
[0008]S2、将浸提液在10000r/min～15000r/min，4℃下离心8min～12min，收集上清液置于离心管并保存于-25℃～-20℃下，残渣再用提取液于-25℃～-20℃提取5h～8h，离心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得离心液；
[0009]S3、将上述离心液过固相萃取柱，收集滤液后，减压蒸馏至无溶剂蒸出为止，得到浓缩物；
[0010]S4、将浓缩物与聚乙烯吡咯烷酮混合，分液后，取上清液；
[0011]S5、上清液过硅胶柱，洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯，进行梯度洗脱，设定等体积为一个馏分收集，检测并合并相同斑点的馏分后，减压蒸馏，干燥得到玉米素。
[0012]进一步的，S1中所述植物的根或茎的质量与所述提取液的体积比为0.5g/mL～1.2g/mL。
[0013]进一步的，所述S3的具体步骤为：
[0014]用1ml 100％甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡C18固相萃取柱，然后将离心液通过置于真空抽滤装置上的96孔C18固相萃取柱，并连接上真空泵，以1ml/min的速度抽滤，收集滤液。
[0015]进一步的，S4中每1mL聚乙烯吡咯烷酮中溶解0.05g浓缩物。
[0016]进一步的，S5上清液过硅胶柱为称取适量200目～300目细硅胶装入到玻璃柱中，使硅胶自由沉降，将S4中的上清液上样到细硅胶柱中；
[0017]且按照二氯甲烷：乙酸乙酯的体积比为13:1；9:1；7:1；6:1；2:1进行梯度洗脱。
[0018]进一步的，S5中设定为15mL为一个馏分收集。
[0019]进一步的，S5中的斑点为采用薄层层析谱检测后得到的斑点。
[0020]本发明中的植物为杧果、水稻、油菜、拟南芥、番茄或烟叶等植物。
[0021]将减压蒸馏得到的玉米素用谱级甲醇溶解，用HPLC技术检测。
[0022]其中，所述HPLC技术的具体参数如下：
[0023]谱柱：Agilent SB-C18谱柱(4.6mm×250mm，5μm，上海安捷伦科技有限公司)；[0024]流动相A：超纯水；
[0025]流动相B：(谱纯)；
[0026]紫外检测波长：245nm
[0027]流速：0.3mL/min；
[0028]柱温：35℃；
[0029]流动相洗脱梯度见表1；
[0030]表1液相谱线性梯度洗脱程序
[0031]
[0032]与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0033]本发明的纯化方法操作简单，成本低。此外纯化方法中的玉米素的收率高，纯度高达97％。
具体实施方式
[0034]为了使本发明的技术手段、创作特征、达到目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明的具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0035]实施例1
[0036]一种细胞分裂素的制备方法，包括如下步骤：
[0037]S1、取植物的根或茎，用液氮冷冻后，研磨成粉末，再向粉末中加入提取液，-25℃下浸提10h，得到浸提液；植物的根或茎的质量与所述提取液的体积比为0.5g/mL，所述植物为杧果。
[0038]提取液为甲醇溶液，甲醇溶液中甲醇与水的体积比为4:1；
[0039]S2、将浸提液在10000r/min，4℃下离心12min，收集上清液置于新管并保存于-25℃下，残渣再用提取液于-25℃提取5h，离心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得离心液；
[0040]S3、将上述离心液过固相萃取柱，收集滤液后，减压蒸馏至无溶剂蒸出为止，得到浓缩物；
[0041]具体步骤为：
[0042]用1ml甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡C18固相萃取柱，然后将离心液通过置于真空抽滤装置上的C18固相萃取柱，并连接上真空泵，以1ml/min的速度抽滤，收集滤液。[0043]S4、将浓缩物与聚乙烯吡咯烷酮混合，分液后，取上清液；每1mL聚乙烯吡咯烷酮中溶解0.05g浓缩物；
[0044]S5、上清液过硅胶柱，洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯，进行梯度洗脱，设定等体积为一个馏分收集，检测并合并相同斑点的馏分后，减压蒸馏，干燥得到玉米素；
[0045]具体步骤为
[0046]称取200目～300目细硅胶装入到玻璃柱中，使硅胶自由沉降，将S4中的上清液上样到细硅胶柱中；
[0047]且按照二氯甲烷：乙酸乙酯的体积比为13:1；9:1；7:1；6:1；2:1进行梯度洗脱。[0048]且设定为15mL为一个馏分收集，斑点为采用薄层层析谱检测后得到的斑点。[0049]然后将得到的玉米素用谱级甲醇溶解，用HPLC技术检测，结果显示玉米素标准物质的液相出峰时间为24.11m i n，在相同条件下，本申请的某一组分出峰时间为24.873min，和玉米素标准品的出峰保留时间相近，于是判断该组分
为玉米素。
[0050]且经过测定本发明的玉米素的含量为96.7％.
[0051]实施例2
[0052]一种细胞分裂素的制备方法，所述细胞分裂素为玉米素，包括如下步骤：[0053]S1、取植物的根或茎，用液氮冷冻后，研磨成粉末，再向粉末中加入提取液，-20℃下浸提12h，得到浸提液；植物的根或茎的质量与提取液的体积比为1.2g/mL，所述置物为水稻；
[0054]提取液为甲醇溶液，甲醇溶液中甲醇与水的体积比为4:1；
[0055]S2、将浸提液在15000r/min，4℃下离心8min，收集上清液置于离心管并保存于-20℃下，残渣再用提取液于-20℃提取8h，离心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得离心液；
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