(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110006777.9
(22)申请日 2021.01.05
(71)申请人 雅本化学股份有限公司
地址 215433 江苏省苏州市太仓市太仓港
港口开发区石化区东方东路18号
申请人 湖州颐辉生物科技有限公司
(72)发明人 陶荣盛 原犇犇 朱傅赟 郑云
沈正权 孙梁栋 潘震华 沈青
胡海亮 刘萍
(74)专利代理机构 上海申浩律师事务所 31280
代理人 贾师英
(51)Int.Cl.
C12N 1/21(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C12N 15/75(2006.01)
C12N 15/77(2006.01)C12P 7/50(2006.01)C12R 1/19(2006.01)C12R 1/15(2006.01)C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称
微生物转化法制备α-酮戊二酸
(57)摘要
现了L ‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶在微生物细
胞内的高水平共表达，经过一次发酵即可获得两
种酶，简化了发酵工艺。本发明提供了使用共表
达L ‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的基因工程菌
高效合成α‑酮戊二酸的新工艺，显著提高了生
产效率和收率，减少了丁二酸生成量，降低了α‑
酮戊二酸的生产成本，具有很高的工业化应用价
值。权利要求书1页 说明书7页序列表23页CN 112625993 A 2021.04.09
C N 112625993
A
1.一种共表达L ‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的基因工程菌，其中所述L ‑谷氨酸氧化酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.1，所述过氧化氢酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，
编码L ‑谷氨酸氧化酶SEQ ID NO.1的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；
编码过氧化氢酶SEQ ID NO.3的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；
编码过氧化氢酶SEQ ID NO.5的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.6；
编码过氧化氢酶SEQ ID NO.7的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.8；
编码过氧化氢酶SEQ ID NO.9的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.10；
编码过氧化氢酶SEQ ID NO.11的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.12；
编码过氧化氢酶SEQ
ID NO.13的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.14。3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述过氧化氢酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.9，且其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.10。
4.一种构建如权利要求1‑3中任一项所述的基因工程菌的方法，其特征在于，采用质粒转化、同源重组技术或者基因编辑技术将编码所述L ‑谷氨酸氧化酶的基因和编码所述过氧化氢酶的基因整合入宿主细胞的基因组中，得到基因工程菌。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述宿主选自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主大肠杆菌BL21(DE3)。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述质粒转化包括如下步骤：
(1)全基因合成编码所述L ‑谷氨酸氧化酶的基因和编码所述过氧化氢酶的基因；
(2)分别将编码所述L ‑谷氨酸氧化酶的基因和编码所述过氧化氢酶的基因通过NdeI和BamHI酶切位点克隆到质粒pET24a(+)上，分别得到pET24a ‑谷氨酸氧化酶质粒和pET24a ‑过氧化氢酶质粒；或者再通过酶切和连接的方式得到pET24a ‑谷氨酸氧化酶+过氧化氢酶质粒；或者将编码所述L ‑谷氨酸氧化酶的基因与编码所述过氧化氢酶的基因通过自剪切多肽2A相融合从而形成融合基因，然后将融合基因通过NdeI和BamHI酶切位点克隆到质粒pET24a(+)上，得到pET24a ‑谷氨酸氧化酶+过氧化氢酶质粒；
(3)通过电转法或者化学转化法(氯化钙法)将步骤1中得到的质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，筛选出酶切验证正确的阳性克隆株，得到正确的共同表达L ‑谷氨酸氧化酶和各个过氧化氢酶的菌种。
8.一种制备α‑酮戊二酸的方法，其特征在于，在合适的反应条件下，向反应体系中加入权利要求1‑7中任一项所述的基因工程菌，将反应底物L ‑谷氨酸催化转化为α‑酮戊二酸。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，反应底物L ‑谷氨酸是以L ‑谷氨酸钠一水合物的形式提供。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，控制反应体系pH6.0‑8.0；温度25‑45℃。
权 利 要 求 书1/1页CN 112625993 A
微生物转化法制备α‑酮戊二酸
技术领域
[0001]本发明属于生物催化技术领域，涉及一种微生物转化法制备α‑酮戊二酸的方法，具体地说，涉及一种新的微生物酶催化法合成α‑酮戊二酸的方法。
背景技术
[0002]α‑酮戊二酸(α‑ketoglutaric acid)是自然界中一种重要的代谢中间产物，参与机体内氨基酸、糖类、蛋白质和脂肪等多种物质代谢。α‑酮戊二酸还是一种重要的化学合成原料和中间体，在医药上是合成氨基酸和肽类的重要原料，被广泛应用于饲料、保健食品、精细化工等领域。目前，α‑酮戊二酸的生产方法主要有化学合成法，微生物发酵法和酶转化法。化学合成法需要用到有机溶剂，腈化物等有毒原料，污染环境，步骤繁多，副反应多，成本高，不符合环保和工业化成本的要求。微生物发酵法生产周期长，杂酸种类多且含量高，产物分离提取工艺复杂，导致产品收率低，成本高。酶转化法选择性好，杂质少，产品浓度高，并且能耗低，周期短，已经逐渐成为α‑酮戊二酸生产工艺的主流，并且仍在不断改进中。[0003]目前，α‑酮戊二酸的酶法工艺包含L‑谷氨酸氧化酶法，L‑氨基酸(谷氨酸)脱氨酶法和L‑谷氨酸脱氢酶法。CN103911400A采用L‑氨基酸脱氨酶突变体转化L‑谷氨酸生产α‑酮戊二酸，转化率最高为85.25％。CN106834366A以L‑谷氨酸及其盐为原料，经L‑谷氨酸脱氢酶催化制备α‑酮戊二酸，该工艺需要用到辅因子，辅因子通过有机小分子再生催化剂再生，该工艺是一种有益的探索，但由于产物浓
度太低，无法工业应用。辅因子的再生以及催化剂的成本都会造成工业应用的困难。CN109988786A采用L‑谷氨酸或L‑谷氨酸盐为原料，经L‑谷氨酸氧化酶催化制备α‑酮戊二酸，并通过流加过氧化氢酶控制丁二酸含量在0.1‑1.0g/ L，产物浓度可以做到135.5g/L，转化率为99.9％。CN106047913A采用经过优化的L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶共表达菌株，催化L‑谷氨酸制备α‑酮戊二酸，可以达到127.1g/L的产物浓度和96.9％的转化率。CN110283800A以L‑谷氨酸盐为底物，采用L‑谷氨酸氧化酶突变体和过氧化氢酶共表达的重组菌株，通过酶反应可以得到205g/L的产物浓度，转化率可以达到97.5％。
[0004]从这些专利可以看出，L‑氨基酸脱氨酶法和L‑谷氨酸脱氢酶法的工业化仍有较大困难，L‑氨基酸脱氨酶产生的氨在高浓度下也会对反应有抑制，L‑谷氨酸脱氢酶需要用到NAD+或者NADP+辅因子，这些辅因子的成本或者再生成本较高，由于这些原因，L‑谷氨酸氧化酶法是最具优势的酶法，该法在反应中产生的过氧化氢，如果不及时除去，不仅会降低酶的活力，还会将α‑酮戊二酸氧化为丁二酸，丁二酸的存在不利于α‑酮戊二酸的分离纯化，专利CN 109988786 A采用流加过氧化氢酶的方法增加了成本，并且需要时刻监控丁二酸浓度，操作较复杂。CN106047913A和CN110283800A采用L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶共表达的方法，降低了过氧化氢酶的成本，但收率偏低，究其原因，可能是共表达的过氧化氢酶表达量不够，对过氧化氢的亲和力不够或者稳定性不好，导致反应产生的过氧化氢酶不能及时被清除。因此过氧化氢酶是提高产品收率的一个至关重要的因素。
发明内容
[0005]为了改进现有技术的微生物表达L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶来催化制备α‑酮戊二酸的方法，发明人对于L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的种类分别进行了广泛筛选，并且构建了多种过氧化氢酶与L‑谷氨酸氧化酶共表达菌种，这些菌种通过微生物发酵得到包含L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的菌体，采用这些菌体转化L‑谷氨酸钠来制备α‑酮戊二酸，得到了较高产品浓度和转化率，并且副产物丁二酸含量低，从而提供了一种简单高效的α‑酮戊二酸制备方法。具体地，本发明包括如下技术方案：
[0006]一种共表达L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的基因工程菌，其中所述L‑谷氨酸氧化酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.1，所述过氧化氢酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13。
[0007]其中L‑谷氨酸氧化酶SEQ ID NO.1来源于链霉菌Streptomyces sp X‑119‑6，本文中简称为Lgox；
[0008]过氧化氢酶SEQ ID NO.3来源于百日咳博德特氏菌Bordetella pertussis，本文中简称为katA；
[0009]过氧化氢酶SEQ ID NO.5来源于大肠杆菌Escherichia coli，本文中简称为katE；[0010]过氧化氢酶SEQ ID NO.7来源于大肠杆菌Escherichia coli，本文中简称为KatG；[0011]过氧化氢酶SEQ ID NO.9来源于嗜树木甲烷短杆菌Methanobrevibacter arboriphilus，本文中简称为Makat；
[0012]过氧化氢酶SEQ ID NO.11来源于闪烁古生球菌Archaeoglobus fulgidus DSM 4304，本文中简称为perA；
[0013]过氧化氢酶SEQ ID NO.13来源于褐嗜热裂孢菌Thermobifida fusca，本文中简称为TfuCat。本发明的第二个方面提供了一种编码上述L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的基因。
[0014]例如，编码L‑谷氨酸氧化酶SEQ ID NO.1的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；[0015]编码过氧化氢酶SEQ ID NO.3的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；
[0016]编码过氧化氢酶SEQ ID NO.5的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.6；
[0017]编码过氧化氢酶SEQ ID NO.7的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.8；
[0018]编码过氧化氢酶SEQ ID NO.9的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.10；
[0019]编码过氧化氢酶SEQ ID NO.11的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.12；
[0020]编码过氧化氢酶SEQ ID NO.13的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.14。
[0021]优选地，上述过氧化氢酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.9，且其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.10。
[0022]本发明的第三个方面提供了一种构建上述基因工程菌的方法，例如，可以采用质粒转化、同源重
组技术或者基因编辑技术将编码所述L‑谷氨酸氧化酶的基因和编码所述过氧化氢酶的基因整合入宿主细胞的基因组中，得到基因工程菌。
[0023]上述基因编辑技术可以采用CRISPR‑Cas9系统、CRISPR‑Cpf1系统、CRISPR‑Cas相关的转座系统INTEGRATE系统或者CAST系统。
[0024]上述INTEGRATE系统是指Sam Sternberg研究组开发的基因编辑工具(Insertion of transposable elements by guide RNA‑assisted targeting，引导RNA辅助靶向的转
座元件插入)；CAST系统是指张锋研究组开发的基因编辑工具(CRISPR‑associated transposase，CRISPR相关转座酶)。
[0025]上述基因工程菌的宿主优选是细菌，比如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌等。优选大肠杆菌，包括但不限于大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli BL21(DE3)plysS或者Escherichia coli BL21(DE3)star。更优选是大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0026]作为最传统的方法，采用质粒转化法将L‑谷氨酸氧化酶基因和过氧化氢酶基因整合入宿主细胞的基因组中。典型地，所述质粒转化包括如下步骤：
[0027](1)全基因合成编码所述L‑谷氨酸氧化酶的基因和编码所述过氧化氢酶的基因；[0028](2)分别将编
码所述L‑谷氨酸氧化酶的基因和编码所述过氧化氢酶的基因通过NdeI和BamHI酶切位点克隆到质粒pET24a(+)上，分别得到pET24a‑谷氨酸氧化酶质粒和pET24a‑过氧化氢酶质粒；或者再通过酶切和连接的方式得到pET24a‑谷氨酸氧化酶+过氧化氢酶质粒；或者
[0029]将编码所述L‑谷氨酸氧化酶的基因与编码所述过氧化氢酶的基因通过自剪切多肽2A相融合从而形成融合基因，然后将融合基因通过NdeI和BamHI酶切位点克隆到质粒pET24a(+)上，得到pET24a‑谷氨酸氧化酶+过氧化氢酶质粒；
[0030](3)通过电转法或者化学转化法(氯化钙法)将步骤1中得到的质粒(pET24a‑谷氨酸氧化酶质粒和pET24a‑过氧化氢酶质粒、或者pET24a‑谷氨酸氧化酶+过氧化氢酶质粒)转化到BL21(DE3)感受态细胞中，筛选出酶切验证正确的阳性克隆株，得到正确的表达L‑谷氨酸氧化酶和表达各个过氧化氢酶的菌种。
[0031]其中用于形成融合基因的自剪切多肽2A(self‑cleaving 2A peptide，2A)或称可自切割2A peptide，其可以选自P2A、E2A、T2A、F2A，但不限于此。
[0032]本发明的另一个方面提供了一种上述基因工程菌在制备α‑酮戊二酸中的应用，即提供一种制备α‑酮戊二酸的方法，其包括，在合适的反应条件(比如提供氧气或空气，合适的温度和pH)下，向反应体系中加入权利要求1‑7中任一项所述的基因工程菌经过微生物产酶发酵得到的菌体，将反应底物L‑谷氨
酸钠催化转化为α‑酮戊二酸。
[0033]在一种优选的实施方式中，反应底物L‑谷氨酸是以价格相对低廉的工业产品谷氨酸钠一水合物的形式提供。
[0034]在反应过程中，控制反应体系pH6.0‑8.0、优选pH6.5‑7.5、更优选pH7.0左右；温度25‑45℃、优选28‑42℃、更优选30‑40℃、更优选32‑38℃、最优选35℃左右。
[0035]上述反应可以在发酵罐或反应釜内进行，此时，控制转速600‑1000rpm，通气量1‑2vvm/min，罐压0.05‑0.1mpa，溶氧30‑40％。
[0036]与现有技术相比，本发明进一步优化了特定的L‑谷氨酸氧化酶与特定的过氧化氢酶的组合，显著提高了制备α‑酮戊二酸的效率和收率，有效抑制了副产物丁二酸的产生，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
[0037]本发明提供的基因工程菌实现了优选的L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的共表达。为了在不同微生物中进行酶蛋白的最佳表达，可以针对特定的微生物比如大肠杆菌进行密
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