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作为长效GLP-1/升糖素受体激动剂以脂肪肝疾病及脂肪肝炎的升糖素类似物的制作方法

作为长效glp-1/升糖素受体激动剂以脂肪肝疾病及脂肪肝炎的升糖素类似物
技术领域
1.本发明涉及具有双重glp-1/升糖素受体激动剂活性的特定长效升糖素类似物的医疗用途，其用于预防和/或代谢性肝脏疾病，尤其是非酒精性脂肪肝疾病(nafld)、非酒精性脂肪肝(nafl)、非酒精性脂肪肝炎(nash)、nafld相关的肝纤维化和/或肝硬化。

背景技术：

2.脂肪肝疾病是以过量的肝脏三酸甘油酯沉积为特征的慢性病状。其可由多种原因导致，主要的两种形式与过度的饮酒或在不存在过量酒精摄入的情况下的代谢失调相关。后者称为非酒精性脂肪肝疾病(nafld)。其通常与代谢综合征及其个别组分(肥胖症、2型糖尿病、血脂异常及高血压)有关。nafld的范围介于也称为非酒精性脂肪肝(nafl)的经分离肝脏脂肪变性至以肝脏三酸甘油酯累积、肝细胞损伤及小叶发炎为特征的非酒精性脂肪肝炎(nash)，至肝纤维化。值得注意的是，纤维化在患有nash的患者中可存在各种程度。nash伴以纤维化的存在是罹患肝硬化及潜在肝细胞癌的强烈风险因素(hagstrom等人,journal of hepatology 2017,第67卷,第1265-1273页)。
3.nafld为常见病状；全球发病率经估计高达25％(younossi等人,hepatology 2016,第64卷,第73-84页)。从相对良性病状的nafl至nash的过渡且尤其是纤维化的进展与总体死亡率的风险增加有关(参见例如dulai等人,hepatology 2017,第65卷,第1557-1565页)。
4.已知nafld为由各种致病源(例如胰岛素抗性、脂毒性及发炎反应)引起。其中，最常见病因为胰岛素抗性。
5.已作出大量努力以改良胰岛素抗性以预防/非酒精性脂肪肝疾病。例如，已实施噻唑烷二酮(tzd)或二甲双胍(metformin)(一种胰岛素敏化剂)的临床试验(参见hepatology(2003)38:1008-17,j clin invest(2001)108:1167-74)。
6.然而，在用基于tzd的药物的情况下，存在较大体重增加及液体滞留的缺点，且因此得知不可能针对患有心脏病的患者使用此类。除了基于tzd的药物以外，还已针对nafld实施使用例如维康特(victoza)(利拉鲁肽(liraglutide))或艾塞那肽(byetta)的glp-1受体激动剂的临床测试。
7.利拉鲁肽为升糖素样肽-1(glp-1)的市售化学修饰类似物。利拉鲁肽的氨基酸序列显示为seq id no:1
8.haegtftsdvssylegqaak((s)-4-羧基-4-十七酰基-氨基-丁酰基-)eflawlvrgrg(seq id no.:1)
9.利拉鲁肽用作glp-1受体(glp1r)激动剂。已证实此类glp1r激动剂会降低血糖且减轻体重。此外，相较于安慰剂下的9％，用glp1r激动剂利拉鲁肽患有超重或肥胖及活组织切片证实的nash的患者使得39％患者中的nash消退(armstrong等人,bmj open 2013,第3卷,e003995；armstrong等人,lancet 2016,第387卷,第679-690页)。
10.已在nash的啮齿动物模型中测试调酸素(glp-1及升糖素受体的双重激动剂)的聚乙二醇化(pegylated)合成类似物，但相比于单一激动剂glp-1及升糖素具有降低的亲和力(valdecantos等人,hepatology 2017,第65卷,第950-968页)。在部分肝切除术之后，在微数组及肝脏再生中分析称为g49且具有29个氨基酸长度的类似物。
11.wo 2014/091316涉及升糖素及glp-1的共激动剂。wo 2017/153575公开这些共激动剂的其他数据，包括g933的临床试验的数据。g933的几何平均半衰期似乎为约10至12小时。
12.wo 2014/056872 a1及wo 2018/100174 a1公开使glp-1及升糖素受体活化的唾液素-4(exendin-4)衍生物。在这些唾液素-4衍生物中，在其他取代中，位置14的甲硫氨酸经侧链中携载nh2基团的氨基酸置换，其进一步经非极性残基取代(例如，脂肪酸任选与接头组合)。wo 2014/056872报导小鼠中一些唾液素-4衍生物的半衰期(实施例10，表6)。报导值皆低于4h。一些化合物的(例如来自鼠类饮食诱导的nash模型)其他信息提供于wo2019/030268中。
13.wo 2015/055801及wo 2015/055802公开升糖素类似物肽，相比于人类升糖素，该升糖素类似物肽具有针对glp-1受体的增加的选择性。基于这些肽来肥胖症、超重及糖尿病的方法也已公开。
14.预期glp-1及升糖素受体的同时活化会减少摄食量且增加能量消耗且预期会导致患有肥胖症或超重的患者的体重减轻。在通过glp-1受体促效特性提供血糖控制时，通过受体减少食物摄入且通过升糖素受体促效作用增加能量消耗。预期对食物摄入及能量消耗的影响组合会产生比纯glp-1受体激动剂更持久的负能量平衡且引起稳定的体重减轻及nash的改善。假设glp-1与升糖素受体活化的平衡在存在有利的益处风险概况的情况下实现体重减轻及维持，以及改善nash的关键因素。
15.然而，对于上文所提及的化合物，体内半衰期较短，且因此给药必须频繁地重复，例如，每天一次。因为这些给药通常经皮下进行，所以存在患者不便的缺点。此频繁给药造成患者的疼痛及不适。
16.迄今为止，关于nafld范围的病状的药理学尚未经医学授权机构批准。因此，非常需要鉴别出可减缓、停止或逆转nafld(包括nash)进展的时程，或朝向晚期纤维化和/或肝硬化的进展的新颖安全且有效的化合物。
17.此外，需要nafld(包括nash)，其包含施用需要以更低频率施用的(长效)药剂。同时，仍应有效，例如，如通过nafld活动性评分或其他相关生物标志物(例如，肝脏脂肪含量减少或肝酶变化)所判定。
18.用于如本文所公开的中的化合物可能以更低频率施用且仍有效。

技术实现要素：

19.本文提供特定长效双重glp-1/升糖素受体激动剂的医疗用途，其用于预防和/或代谢性肝脏疾病，如非酒精性脂肪肝疾病(nafld)，尤其是非酒精性脂肪肝(nafl)、非酒精性脂肪肝炎(nash)；nafld相关的肝纤维化和/或肝硬化。
20.wo 2015/055 801公开衍生自升糖素的肽化合物，该升糖素(不同于天然升糖素)有效地活化glp-1及升糖素受体。
21.现发现具有双重激动剂活性的式i的升糖素类似物可有效地用于特定肝脏疾病，如nafld，尤其是nash。所有式i的化合物在结构上紧密相关，具有29个氨基酸长度、经酰胺化c-端，且共享22个氨基酸的总体一致性。
22.因此，本发明涉及具有通式i的化合物(包括盐)
23.r-h-x2-qgtftsdyskyl-x15-x16-x17-x18-akdfi-x24-wle-x28-a-nh2ꢀꢀ(i)24.其中
25.r选自h、c
1-4
烷基及乙酰基；
26.x2选自aib及ac4c；
27.x15选自asp及glu；
28.x16选自glu及ψ；
29.x17选自arg及ψ；
30.x18选自ala及arg；
31.x24选自glu及ψ；
32.x28选自ser及ψ；
33.其中该化合物含有一个且仅一个ψ
34.且其中该ψ为lys的残基，其中侧链的氨基与选自由以下组成的组的取代基共轭
35.hooc-(ch2)
16-(co)-isoglu-peg3-peg3-，及
36.hooc-(ch2)
16-(co)-isoglu-gsgsgg-，
37.其用于预防和/或代谢性肝脏疾病，尤其是用于nafld、nash和/或肝硬化的方法中。
38.在一更具体的实施方案中，本发明涉及选自以下的化合物
39.h-h-aib-qgtftsdyskyld-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-peg3-peg3)-raakdfiewlesa-nh2(化合物1，seq id no.:3)
[0040]
h-h-aib-qgtftsdyskylderaakdfi-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-gsgsgg)-wlesa-nh2(化合物2，seq id no.:4)
[0041]
h-h-ac4c-qgtftsdyskylde-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-peg3-peg3)-rakdfiewlesa-nh2(化合物3，seq id no.:5)
[0042]
h-h-aib-qgtftsdyskyle-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-gsgsgg)-raakdfiewlesa-nh2(化合物4，seq id no.:6)
[0043]
h-h-ac4c-qgtftsdyskylderaakdfi-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-gsgsgg)-wlesa-nh2(化合物5，seq id no.:7)
[0044]
h-h-ac4c-qgtftsdyskylderaakdfiewle-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-gsgsgg)-a-nh2(化合物6，seq id no.:8)
[0045]
其用于预防和/或nafld、nash和/或肝硬化的方法中。
[0046]
本发明的其他方面及实施方案将根据以下公开内容变得显而易见。
具体实施方式
[0047]
如上所述，本发明涉及一种化合物，其具有通式i：
[0048]
r-h-x2-qgtftsdyskyl-x15-x16-x17-x18-akdfi-x24-wle-x28-a-nh2ꢀꢀ(i)[0049]
其中
[0050]
r选自h、c
1-4
烷基及乙酰基；
[0051]
x2选自aib及ac4c；
[0052]
x15选自asp及glu；
[0053]
x16选自glu及ψ；
[0054]
x17选自arg及ψ；
[0055]
x18选自ala及arg；
[0056]
x24选自glu及ψ；
[0057]
x28选自ser及ψ；
[0058]
其中该化合物含有一个且仅一个ψ
[0059]
且其中该ψ为lys的残基，其中侧链的氨基与选自由以下组成的组的取代基共轭
[0060]
hooc-(ch2)
16-(co)-isoglu-peg3-peg3-，及
[0061]
hooc-(ch2)
16-(co)-isoglu-gsgsgg-，
[0062]
其用于预防或代谢性肝脏疾病，尤其是用于nafld、nash和/或肝硬化的方法中。
[0063]
除非本文中另外规定，否则本文所使用的科学术语及技术术语应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。
[0064]
贯穿本说明书，术语“包含(comprise)”或变化形式(例如“包含(comprises/comprising)”)应理解为暗示包括所述整体或组分或整体或组分的组但不排除任何其他整体或组分或整体或组分的组。
[0065]
除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a或an)”及“所述”包括复数。
[0066]
术语“包括”用以意指“包括(但不限于)”。“包括”及“包括(但不限于)”可互换使用。
[0067]
术语“患者”、“受试者”及“个体”可互换使用且是指人类动物。
[0068]
式i的以上定义包含以中性或带电状态存在的相应化合物。呈带电状态的化合物例如以盐(例如药学上可接受的盐)形式，或以溶液(特别是以水溶液)存在。
[0069]
如本文所使用，术语“药学上可接受的盐”旨在表示对施用所述盐的患者或受试者无害的盐。其可适当地为例如选自酸加成盐及碱性盐的盐。酸加成盐的实例包括氯化物盐、柠檬酸盐及乙酸盐。碱性盐的实例包括阳离子为选自碱金属阳离子(例如钠或钾离子)、碱土金属阳离子(例如钙或镁离子)以及经取代的铵离子(例如n(r1)(r2)(r3)(r4)
+
型离子)的盐，其中r1、r2、r3及r4典型地独立地表示氢、任选经取代的c
1-6
烷基或任选经取代的c
2-6
烯基。相关c
1-6
烷基的实例包括甲基、乙基、1-丙基及2-丙基。可能相关的c
2-6
烯基的实例包括乙烯基、1-丙烯基及2-丙烯基。药学上可接受的盐的其他实例描述于“encyclopaedia of pharmaceutical technology”,第3版,james swarbrick(编),informa healthcare usa(inc.),ny,usa,2007中的“remington's pharmaceutical sciences”,第17版,alfonso r.gennaro(编),mark publishing company,easton,pa,usa,1985(及其较新的版本)中，及描述于j.pharm.sci.66:2(1977)中。
[0070]
如本发明中采用的术语“激动剂”是指典型地通过与其(即作为配位体)结合来活化所述受体类型的物质。
[0071]
在本说明书中，使用天然存在的氨基酸的常规单字母及三字母编码，以及其他氨基酸的通常可接受的缩写，例如aib(α-氨基异丁酸)及ac4c(1-氨基-环丁烷甲酸)。术语“isoglu”是指γ-谷氨酸单元。
[0072]
除非另外指明，否则参考所述氨基酸的l-异构形式。
[0073]
其他缩写包括以下：
[0074]
nafl：非酒精性脂肪肝
[0075]
nafld：非酒精性脂肪肝疾病
[0076]
nas：nafld活动性评分
[0077]
nash：非酒精性脂肪肝炎
[0078]
mri-pdff：磁共振成像质子密度脂肪分数
[0079]
如本文在本发明的上述或其他性干预方法的上下文中所使用的术语“有效量”是指足以治愈、改善、减轻或部分遏制作为所述或其他性干预的目标的特定疾病、病症或病状的临床表达的量，例如如通过公认的临床终点或其他生物标志物(公认的或实验的)，包括肝活组织检查。学上相关量可由本领域技术人员基于所或预防的病症及接受该学上相关量给药的受试者凭经验确定。举例而言，本领域技术人员可测量本文所描述的生物活性的一种或多种临床上的相关指标，例如，经由mri-pdff的肝脏脂肪含量、体重或nas(nafld活动性评分)。本领域技术人员可经由体外或体内测量值来确定临床相关量。其他示例性测量包括纤维化标记(血清或血浆)、体重减轻、nash或纤维化的组织学评分的变化、肝脏脂肪含量减少及肝酶的变化。
[0080]
将足以实现任何或所有这些作用的量定义为有效量。可定制给药量及给药方法以实现最佳功效。有效用于既定目的的量将尤其取决于作为特定或其他性干预的目标的疾病、病症或病状的严重程度、所述受试者的体重及一般状况、饮食、可能的并行药物及医药领域技术人员熟知的其他因素。本发明获得的结果可引导确定最适于向人类施用本发明的肽或其药学上可接受的盐的适合的剂量大小及给药方案，且所述适合的剂量大小及给药方案可在经适当设计的临床试验中确认。有效剂量及方案可通过常规手段确定，开始在实验动物中使用低剂量，且随后增加剂量，同时监测效果，且同样系统地改变给药方案。当针对既定受试者确定最佳剂量时，临床医师可考虑许多因素。此类考虑因素为本领域技术人员所熟知。
[0081]
如本发明中使用的术语“”及其语法变体(例如“(treated/treating/treat)”是指用于获得有利的或所需的临床结果的途径。出于本发明的目的，有利的或所需的临床结果包括(但不限于)缓解症状、减轻疾病严重程度、使疾病状态稳定(即不恶化)、推迟或减缓疾病进程、改良或缓和疾病状态及缓解(无论部分或完全)，无论可检测或不可检测。“”也可意指与若未接受的预计存活时间相比延长的存活时间。因此，需要的受试者(例如人类)可为已罹患所述疾病或病症的受试者。术语“”包括相对于未进行，抑制或减轻病理状态或症状的严重程度增加(例如，进展成肝硬化、纤维化的进展或nash的恶化，例如，nas增加)，且无需意指暗示完全停止相关疾病、病症或病状。
[0082]
如本发明中使用的术语“预防”及其语法变体(例如“预防(prevented/preventing/prevent)”)是指妨碍或预防病状、疾病或病症的发展或改变其病理学的途径。因此，“预防”可以指防治性或预防性测量。出于本发明的目的，有利的或所需的临床结果包
括(但不限于)预防或减缓疾病的症状、进程或发展，无论可检测或不可检测。因此，需要“预防”的受试者(例如人类)可为尚未罹患所述疾病或病症的受试者。因此，术语“预防”包括与未进行相比抑制或减缓疾病发作，且无需意指暗示永久性预防相关疾病、病症或病状。在一更特定方面中，预防是指预防肝脏疾病的进展(例如，进展成肝硬化、纤维化的进展或nash的恶化，例如，nas的增加)。
[0083]
在本发明化合物的情形下，可以基团r形式存在的c
1-4
烷基包括(但不限于)c
1-3
烷基，例如甲基、乙基、1-丙基或2-丙基。
[0084]
peg3是指包含乙二醇单元的以下结构单元：
[0085]-nh(ch2)2o(ch2)2och2c(o)nh(ch2)2o(ch2)2och2c(o)-。
[0086]
本技术中所提及的所有出版物、专利及公开专利申请均以引用的方式并入本文中，特别地，wo2015/055 801的内容以引用的方式并入。在冲突的情况下，将以本说明书(包括其特定定义)为准。
[0087]
本文所描述的本发明的各实施方案可单独或与本发明的一个或多个其他实施方案组合获取。
[0088]
根据式i的所有化合物共享29个位置中的至少22个的序列一致性。在化合物含有仅一个ψ的限制下，可能的变化形式进一步受限制，因此有效存在仅4个可变位置，从而产生至少86％的序列一致性。此外，其共享相同的酰胺化c端，且lys残基处的取代基(位置16、17、24或28的ψ)选自两种不同替代物，即hooc-(ch2)
16-(co)-isoglu-peg3-peg3-及hooc-(ch2)
16-(co)-isoglu-gsgsgg-。其结构展示于此处(在各情况下，
‑‑‑
指示与ψ(lys)的氨基酸组分的侧链的连接点)：
[0089]
hooc-(ch2)
16-(co)-isoglu-peg3-peg3-或
[0090]
[17-羧基-十七酰基]-isoglu-peg3-peg3：
[0091][0092]
hooc-(ch2)
16-(co)-isoglu-gsgsgg或
[0093]
[17-羧基-十七酰基]-isoglu-gsgsgg：
[0094][0095]
化合物1至6为glp-1及升糖素受体激动剂，如在适当分析中通过其刺激胞内camp形成的能力所测定(例如，如wo2015/055801，实施例2，第36页，表1及实施例3及4，第37-40页，表2及3中所公开)。
[0096]
性用途
[0097]
在第一方面中，如下文所论述，本发明的化合物可提供尤其伴有及不伴有纤维化/肝硬化的非酒精性脂肪肝炎(nash)及包括肥胖症及2型糖尿病的代谢性疾病的和/或
预防选项。
[0098]
代谢综合征由一个个体内的一组代谢性风险因素表征。所述风险因素包括腹部肥胖症(腹部内脏周围的脂肪组织过量)、致动脉粥样硬化血脂异常(血液脂肪病症，包括高三酸甘油酯、低hdl胆固醇和/或高ldl胆固醇，其促进动脉壁中的斑块积聚)、血压升高(高血压)、胰岛素抗性及葡萄糖不耐、血栓前状态(例如，血液中的较高血纤维蛋白原或纤维蛋白溶酶原活化抑制剂-1)及促炎性状态(例如，血液中的c-反应蛋白升高)，及非酒精性脂肪肝疾病(nafld，包括伴有或不伴有纤维化/肝硬化的nash)。
[0099]
在不希望受任何特定理论束缚的情况下，相信本发明的化合物在人类升糖素-受体及人类glp1-受体上充当双重激动剂，在本文简称为双重glp-1/升糖素激动剂。双重激动剂可将升糖素对例如脂肪代谢的作用与glp-1对例如血糖含量及食物摄入的作用组合。其可因此用以加速过量脂肪组织的消除(包括肝脏中的脂肪酸氧化)，诱导可持续的体重减轻且改善肝脏中的脂肪变性及发炎。因此，本发明的化合物可用于通过减少肝脏脂肪，例如，通过增加脂质氧化来nafld。双重glp-1/升糖素激动剂也可用以减少心脏血管风险因素，例如高胆固醇、高ldl-胆固醇或低hdl/ldl胆固醇比率。
[0100]
因此，本发明的化合物可作为nash及后续纤维化/肝硬化、促进体重减轻、肥胖症以及相关疾病及健康病状(包括(但不限于)与代谢综合征有关的发炎及nash相关的肝细胞癌)的药剂，用于有需要的受试者。本发明的化合物也可用于有需要的受试者的由葡萄糖控制异常造成或与葡萄糖控制异常相关的病症，包括胰岛素抗性、葡萄糖不耐、前期糖尿病、空腹葡萄糖增加、2型糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、外围动脉疾病及中风。这些病状中的一些可与代谢综合征及nash/nafld相关。然而，本发明化合物对这些病状的作用可完全或部分经由对体重的作用介导，或可与其无关。
[0101]
因此，本发明提供本发明化合物的用途，其用于有需要的个体中如上文所描述的病状。举例而言，所描述的化合物可用于改善nash和/或纤维化、预防肝硬化进展、逆转肝硬化且促进体重减轻。
[0102]
在一特定实施方案中，本发明包括化合物在非酒精性脂肪肝疾病、代谢及酒精性脂肪肝疾病和/或代谢综合征的疾病集病状的方法中的用途，例如，和/或预防有需要的个体的非酒精性脂肪肝(nafl)、不伴有纤维化的nash、伴有纤维化的nash、nash相关的肝硬化、nash有关的发炎、超重及肥胖症、前期糖尿病、糖尿病、尤其是2型糖尿病、高血压、致动脉粥样血脂异常、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病、中风或微血管疾病。
[0103]
在另一方面中，本发明涉及一种具有通式i(如上文所定义)的化合物，其用于预防或代谢性肝脏疾病的方法中。
[0104]
在一相关方面中，本发明涉及一种包含具有通式i(如上文所定义)的化合物的药物组合物，其用于预防或代谢性肝脏疾病的方法中。
[0105]
在另一方面中，本发明涉及一种预防或有需要的患者的代谢性肝脏疾病的方法，其包括向该患者施用有效量的具有通式i(如上文所定义)的化合物。
[0106]
在一相关方面中，本发明涉及一种预防或有需要的患者的代谢性肝脏疾病的方法，其包括向该患者施用包含有效量的具有通式i(如上文所定义)的化合物或其盐的药物组合物。
[0107]
如本文中所使用，术语“代谢性肝脏疾病”是指酒精诱导的肝脏疾病(也称为酒精性肝脏疾病，ald)、非酒精性肝脏疾病以及其组合。代谢性肝脏疾病包括以肝脏脂肪沉积(例如，过量的肝脏脂肪沉积)为特征的病状范围，包括非酒精性脂肪肝疾病(nafld)，更特别是，非酒精性脂肪肝(nafl)、非酒精性脂肪肝炎(nash)、nafld相关的肝纤维化及nafld相关的肝硬化。
[0108]
ald范围介于酒精性脂肪肝(脂肪变性)经由酒精性脂肪肝炎(ash)达至肝脏纤维化及肝硬化。脂肪变性为酒精性肝脏疾病的最早阶段及最常见的酒精诱导的肝脏病症。若及时停止过量的酒精摄入，则其为可逆的。ash通过脂肪肝的存在定义，为一种发炎性浸润，其主要由多形核白血球及肝细胞损坏组成。
[0109]
非酒精性肝脏疾病与不存在过量酒精摄入的情况下的代谢失调相关。在本发明的上下文中备受关注的非酒精性肝脏疾病为非酒精性脂肪肝疾病(nafld)。nafld为在不存在其他病因的情况下存在肝脏脂肪变性以引起继发性脂肪累积(例如，重度饮酒)。患有nafld的患者具有肝脏脂肪变性，伴有或不伴有发炎、肝细胞损坏或纤维化/肝硬化。
[0110]
在本发明的上下文中，nafld细分成非酒精性脂肪肝(nafl)、非酒精性脂肪肝炎(nash)、nafld相关的肝纤维化及nafld相关的肝硬化。因此，患有根据本发明的nafld的患者必须诊断患有nafl或nash和/或nafld相关的肝纤维化/肝硬化。值得注意的是，在患有nash的个体中，纤维化可典型地呈现自轻度(组织学纤维化阶段f1，kleiner等人)至肝硬化(组织学纤维化阶段f4)的各种程度。在nafl中，存在肝脏脂肪变性而无肝细胞气球样变及晚期发炎的迹象，而在nash中，肝脏脂肪变性与肝脏发炎相关，其在组织学上不可与酒精性脂肪肝炎进行区分。根据ratziu等人(gastroenterology 2016,第150卷,第1147-1159页)及kleiner及bedossa(gastroenterology 2015,第149卷,第1305-1308页)，通过存在伴有一定发炎程度(除了脂肪变性之外)的肝细胞气球样变将nash与nafl进行区分。用以描述nash的其他术语包括假酒精性肝炎、酒精样肝炎、脂肪肝肝炎、脂肪坏死及糖尿病性肝炎。
[0111]
肝纤维化由肝脏的长期损坏与细胞外基质蛋白的累积连合造成，其为大部分类型的慢性肝脏疾病的特征。工业化国家中肝纤维化的主要病因包括慢性hcv(c型肝炎病毒)感染、酒精滥用及非酒精性脂肪肝炎(nash)。细胞外基质蛋白的累积由形成纤维性瘢痕而使肝脏架构变形，且再生肝细胞节结的后续发展界定肝硬化(bataller及brenner,j clin invest.2005,第115卷,第209-218页)。
[0112]
非酒精性脂肪肝炎是特征为肝活组织检查发现与酒精性肝炎中所见者相同的临床实体；然而，患有nash的患者并未消耗已知会引起肝脏损伤的量的酒精。患有nash的患者通常为具有无症状肝肿大的中年人或老年人，且具有糖尿病或高脂质血症，且呈现有超重或肥胖症并且呈现有不相关的医学问题。对肝活组织检查标本的分析为诊断的基础；肝脏形态学发现范围介于轻度脂肪变性及发炎至细胞变形、纤维化及肝硬化，存在或不存在马洛氏小体(mallory hyaline bodies)。
[0113]
患有nash的患者长时间不具有特定症状，但可进展至肝硬化或肝细胞癌(hcc)。因此，nafld相关的肝硬化及nafld相关的肝细胞癌在本文中也称为nash的后遗症。nash进展成肝硬化的风险在患有晚期纤维化的患者中尤其高。nafld相关的肝硬化为该疾病进一步发展成nafld相关的hcc的重要风险因素。然而，nafld相关的hcc也可发生于没有肝硬化的nash患者中。
[0114]
非酒精性脂肪肝疾病(nafld)可见于全世界且为西方工业化国家中最常见的代谢性肝脏病症，其中nafld、中心型肥胖、2型糖尿病、血脂异常及代谢综合征的主要风险因素为普遍的。在美国，研究报导nafld的盛行率为10％至46％，其中大多数基于生检的研究报导nash的盛行率为3％至5％。在全世界，nafld报导的盛行率为6％至35％(中值20％)(williams cd等人,gastroenterology.201 1:140(1):124-31；vernon g等人,alimwent pharmacol ther.201 1:34(3):274-85；lazo m等人,am j epidemiol.2013；178(1):38-45)。
[0115]
大部分患有nafld的患者无症状，但一些患有nash的患者可抱怨有非肝脏特异性症状，例如疲劳、不适及不明确的右上腹部不适。患者更可能因为实验室试验已公开升高的肝脏氨基转移酶，或腹部成像上附带地检测到肝脏脂肪变性而开始注意。在出现脂肪肝炎后，相比于简单的脂肪变性，肝硬化的风险增加。根据bertot及adams(int j mol sci.2016；17(5):774-85)的出版物，分析患者的nafld至nash、nafld至伴有纤维化的nash、nash至nafld相关的肝硬化及伴有纤维化的nash至肝细胞癌的进展速率。患有nash的患者中存在明显增加的进展成肝硬化的风险，且约25％的患有nafld的患者可在3年的时间段内进展成nash。在确定nash后，且依据额外的风险因素，高达38％的患者随时间推移患上nafld相关的肝硬化。
[0116]
如上文所提及，本发明的一个方面涉及式i的化合物或包含此类化合物的药物组合物的用途，其用于非酒精性脂肪肝疾病(nafld)的方法中。更确切而言，待的疾病状态为非酒精性脂肪肝(nafl)、非酒精性脂肪肝炎(nash)、nafld相关的肝纤维化或nafld相关的肝硬化。
[0117]
在更特定的方面中，式i的化合物或包含此类化合物的药物组合物用于预防或非酒精性脂肪肝炎(nash)的方法中。nash可能与或可能不与不同的肝纤维化阶段(包括肝硬化)相关。
[0118]
在2005年，nash临床研究网络(crn)的病理学委员会研发出用于临床试验的所谓的“nafld活动性评分(nas)”(kleiner等人,hepatology 2005,第41卷,第1313-1321页)。其他评分系统也可用于诊断nafld及其组分的严重程度。
[0119]
nas特定地包括在短期内可能逆转的活动性损伤的特征。nas定义为(i)脂肪变性、(ii)小叶发炎及(iii)肝细胞气球样变的分项评分的未加权总和。各分项评分如下表1中所描述经半定量地分级。
[0120]
表1：nas分项评分的定义
[0121][0122]
通常，nafld为通过》5％的肝细胞中存在脂肪变性来定义，nash为通过另外存在任何程度的肝细胞气球样变性及任何量的小叶发炎性浸润定义(bedossa等人,hepatology 2015,第56卷,第1751-1759页)。
[0123]
根据本发明的nafld及nash的诊断描述于下表2中：
[0124]
表2：根据nas分项评分，nafl相对于nash的诊断算法
[0125][0126]
因此，在本发明的上下文中，如果至少脂肪变性的分项评分(在本文中有时也称为“脂肪变性分项评分”或简称“脂肪变性评分”)》1，则患者经诊断为患有nafld。nash可通过存在伴有或不伴有一定程度发炎(在本文中有时也称为“发炎分项评分”或简称“发炎评分”)的肝细胞气球样变(在本文中有时也称为“气球样变分项评分”或简称“气球样变评分”)与nafl或简单的脂肪变性进行区分。在本上下文中，nash消退已定义为气球样变的消失(分项评分＝0)，以及小叶发炎的消失或仅持续轻度小叶发炎(分项评分＝0或1)
(kleiner及bedossa,gastroenterology 2015,第149卷,第1305-1308页)。此定义用于表2中所描述的诊断算法。
[0127]
为评估本发明的化合物的功效，不仅确定nas评分，而且确定纤维化评分。纤维化评分可例如根据kleiner等人(hepatology 2005,第41卷,第1313-1321页；在本文中也称为“kleiner纤维化评分”)确定，概述于下表3中。
[0128]
表3.kleiner纤维化评分的定义
[0129][0130]
尽管nas确定nafl及nash的程度(较高评分意指较高的疾病活动性)，但kleiner纤维化评分确定纤维化进展的程度。在纤维化不进一步进展时nas的减小才有意义。因此，若nas无恶化(即，增加)或改善(较低评分)，特别是在不存在kleiner纤维化评分的恶化(即，增加)的情况下存在肝细胞气球样变的消失(气球样变评分＝0)，则存在对的积极反应。
[0131]
药物组合物
[0132]
本发明还扩展至包含式i的化合物的组合物，例如药物组合物，其用于预防或代谢性肝脏疾病，尤其是用于nafld和/或nash的方法中。如同本发明的所有方面，应理解，提及式i的化合物涵盖提及呈药学上可接受的盐形式的化合物。
[0133]
式i的化合物可调配为药物组合物，其适合于给药，且其典型地包含有效量的本发明的至少一种化合物，以及药学上可接受的载剂、赋形剂或媒剂。
[0134]
术语“药学上可接受的载剂”包括任一种标准药学载剂。用于用途的药学上可接受的载剂在药学领域中已熟知且描述于例如“remington's pharmaceutical sciences”,第17版,alfonso r.gennaro(编),mark publishing company,easton,pa,usa,1985中。举例而言，可在略微酸性或生理ph下使用无菌盐水及磷酸盐缓冲盐水。合适的ph缓冲剂可为例如，磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、n-三(羟基甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(taps)、碳酸氢铵、二乙醇胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸或乙酸盐(例如呈乙酸钠形式)或其混合物。该术语进一步涵盖美国药典(us pharmacopeia)中列举的用于人类的任何载剂。
[0135]
本发明的药物组合物可呈单位剂型。在此类形式中，组合物分成含有适量的一种或多种活性组分的单位剂量。单位剂型可呈封装制剂形式，该封装含有离散量的制剂，例如小瓶或安瓿中的封装片剂、胶囊或散剂。单位剂型自身也可呈例如胶囊、扁囊剂或片剂形式，或其可为适当数目的这些封装形式中的任一种。单位剂型也可以可注射形式提供于应用装置中，例如呈含有液相(典型地，水相)组合物的笔型装置或自动注射器形式。
[0136]
皮下给药为通常施加肽的最常见途径，且似乎也适用于式i的化合物。针对此情况，可使用一次性使用(提供单个剂量单位的化合物量)或多次使用(提供超过一个剂量
单位的化合物量)的装置。适合的装置包含有具有化合物的液体(例如，水性)调配物的料筒的自动注射器(例如，用于一次性使用)或笔型装置(例如，用于多次使用)。
[0137]
剂量
[0138]
根据式i的化合物的典型剂量可在约0.0005至约5mg/kg体重/周，例如约0.001至约0.5mg/kg体重/周的范围内。所使用的精确剂量可尤其视所的疾病或病症的性质及严重程度、所的受试者的性别、年龄、体重及一般状况、正在经历或将经历的可能的其他、伴随疾病或病症，以及本领域执业医师已知的其他因素而定。
[0139]
组合疗法
[0140]
根据式i的化合物可作为组合疗法的部分与另一活性剂一起施用以肝脏疾病，例如，nafld，尤其是nafl、nash或nafld相关的肝纤维化。在所述情况下，两种活性剂可例如以同一药物组合物或调配物中的组分或以独立调配物一起或单独给予。
[0141]
因此，本发明的肽可与另一药物活性化合物组合使用，该药物活性化合物包括(但不限于)选自由以下组成的组的化合物：aoc3抑制剂、sgc活化剂、fgf21激动剂、gdf15激动剂、hsd17b13抑制剂、khk抑制剂、rorc抑制剂、cgas抑制剂、sting抑制剂、acc抑制剂、fxr激动剂、thrβ激动剂、fgf19激动剂、nlrp3抑制剂、klb/fgfr1c抑制剂、pnpla3抑制剂、αvβ整合素抑制剂、白三烯抑制剂及sglt2抑制剂。
[0142]
在一些实施方案中，本发明涉及一种包含根据式i的化合物或如上文所定义的组合或本发明的药物组合物的装置，用于向受试者递送该化合物。
[0143]
特定实施方案
[0144]
描述本发明的其他实施方案：
[0145]
1.一种化合物，其具有通式i
[0146]
r-h-x2-qgtftsdyskyl-x15-x16-x17-x18-akdfi-x24-wle-x28-a-nh2(i)，
[0147]
其中
[0148]
r选自h、c
1-4
烷基及乙酰基；
[0149]
x2选自aib及ac4c；
[0150]
x15选自asp及glu；
[0151]
x16选自glu及ψ；
[0152]
x17选自arg及ψ；
[0153]
x18选自ala及arg；
[0154]
x24选自glu及ψ；
[0155]
x28选自ser及ψ；
[0156]
其中该化合物含有一个且仅一个ψ
[0157]
且其中该ψ为lys的残基，其中侧链的氨基与选自由以下组成的组的取代基共轭
[0158]
hooc-(ch2)
16-(co)-isoglu-peg3-peg3-，及
[0159]
hooc-(ch2)
16-(co)-isoglu-gsgsgg-，
[0160]
其用于预防或代谢性肝脏疾病的方法中。
[0161]
2.根据实施方案1所述的化合物根据实施方案1使用，其中x2为aib。
[0162]
3.根据实施方案1所述的化合物根据实施方案1使用，其中x2为ac4c。
[0163]
4.根据实施方案1至3中任一项所述的化合物根据实施方案1使用，其中x15为asp。
[0164]
5.根据实施方案1至4中任一项所述的化合物根据实施方案1使用，其中x16为glu。
[0165]
6.根据实施方案1至4中任一项所述的化合物根据实施方案1使用，其中x16为ψ。
[0166]
7.根据实施方案1至6中任一项所述的化合物根据实施方案1使用，其中x17为arg。
[0167]
8.根据实施方案1至6中任一项所述的化合物根据实施方案1使用，其中x17为ψ。
[0168]
9.根据实施方案1至8中任一项所述的化合物根据实施方案1使用，其中x18为ala。
[0169]
10.根据实施方案1至8中任一项所述的化合物根据实施方案1使用，其中x18为arg。
[0170]
11.根据实施方案1至10中任一项所述的化合物根据实施方案1使用，其中x24为glu。
[0171]
12.根据实施方案1至10中任一项所述的化合物根据实施方案1使用，其中x24为ψ。
[0172]
13.根据实施方案1至12中任一项所述的化合物根据实施方案1使用，其中x28为ser。
[0173]
14.根据实施方案1至12中任一项所述的化合物根据实施方案1使用，其中x28为ψ。
[0174]
15.根据实施方案1至14中任一项所述的化合物根据实施方案1使用，其中ψ为lys(-peg
3-peg
3-isoglu-(co)-(ch2)
16-cooh)。
[0175]
16.根据实施方案1至14中任一项所述的化合物根据实施方案1使用，其中ψ为lys(-gsgsgg-isoglu-(co)-(ch2)
16-cooh)。
[0176]
17.实施方案1，其中化合物为
[0177]
h-h-aib-qgtftsdyskyld-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-peg3-peg3)-raakdfiewlesa-nh2(化合物1)。
[0178]
18.实施方案1，其中化合物为
[0179]
h-h-aib-qgtftsdyskylderaakdfi-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-gsgsgg)-wlesa-nh2(化合物2)。
[0180]
19.实施方案1，其中化合物为
[0181]
h-h-ac4c-qgtftsdyskylde-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-peg3-peg3)-rakdfiewlesa-nh2(化合物3)。
[0182]
20.实施方案1，其中化合物为
[0183]
h-h-aib-qgtftsdyskyle-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-gsgsgg)-raakdfiewlesa-nh2(化合物4)。
[0184]
21.实施方案1，其中化合物为
[0185]
h-h-ac4c-qgtftsdyskylderaakdfi-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-gsgsgg)-wlesa-nh2(化合物5)。
[0186]
22.实施方案1，其中化合物为
[0187]
h-h-ac4c-qgtftsdyskylderaakdfiewle-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-gsgsgg)-a-nh2(化合物6)。
[0188]
23.如实施方案1至22中任一项所述的化合物，其中化合物呈盐形式，更特别是呈药学上可接受的盐的形式。
[0189]
24.如实施方案1至23中任一项所述的化合物，其用于预防或非酒精性脂肪肝疾病(nafld)(包括非酒精性脂肪肝炎(nash)、非酒精性脂肪肝(nafl)或nafld相关的肝纤维化和/或肝硬化)的方法中。
[0190]
25.实施方案24，其中代谢性肝脏疾病为nafl。
[0191]
26.实施方案24，其中代谢性肝脏疾病为nash，任选与肝纤维化相关的nash(例如，晚期肝纤维化)。
[0192]
27.实施方案24，其中代谢性肝脏疾病为nafld相关的肝纤维化，例如晚期肝纤维化(纤维化阶段中度(f2)及严重(f3))。
[0193]
28.实施方案24，其用于nas评分为至少2的患者。
[0194]
29.实施方案25，其用于nas评分为至少2的患者。
[0195]
30.实施方案26，其用于nas评分为至少2的患者。
[0196]
31.实施方案24，其用于nas评分为至少3的患者。
[0197]
32.实施方案25，其用于nas评分为至少3的患者。
[0198]
33.实施方案26，其用于nas评分为至少3的患者。
[0199]
34.实施方案24，其用于nas评分为至少4的患者。
[0200]
35.实施方案25，其用于nas评分为至少4的患者。
[0201]
36.实施方案26，其用于nas评分为至少4的患者。
[0202]
37.根据28至36中任一项所述的实施方案，其中nas评分中的至少1分由气球样变分项评分引起。
[0203]
38.根据28、30、31、33、34及36中任一项所述的实施方案，其中nas评分中的至少1分由气球样变及发炎分项评分各自引起。
[0204]
39.根据28至38中任一项所述的实施方案，其中nas评分经生检证实。
[0205]
40.根据实施方案1至23中任一项所述的化合物，其用于预防nafl、nash或nafld相关的肝纤维化的进展的方法中。
[0206]
41.实施方案24至40中的任一项，其中该方法包括预防nas分项评分(脂肪变性、发炎或气球样变)中之一的恶化。
[0207]
42.实施方案24至41中的任一项，其中该方法包括预防nas评分的恶化。
[0208]
43.实施方案24至42中的任一项，其中该方法包括提高脂肪变性分项评分。
[0209]
44.实施方案24至43中的任一项，其中该方法包括提高气球样变分项评分。
[0210]
45.实施方案24至44中的任一项，其用于超重或肥胖患者。
[0211]
46.实施方案24至44中的任一项，其用于肥胖患者。
[0212]
47.实施方案24至44中的任一项，其用于bmi≥27kg/m2的患者。
[0213]
48.实施方案47，其中患者患有其他肥胖症相关的共病。
[0214]
49.实施方案48，其中所述共病选自由以下组成的组：2型糖尿病、高血压、血脂异常、睡眠呼吸中止症及心血管疾病。
[0215]
50.实施方案24至44中的任一项，其用于bmi≥30kg/m2的患者。
[0216]
51.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至23中任一项所述的化合物及药学上可接受的载剂以用于预防或代谢性肝脏疾病的方法中。
[0217]
52.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至23中任一项所述的化合物及药学上
可接受的载剂以用于nafld(包括nash、nafl及nafld相关的肝纤维化和/或肝硬化)的方法中。
[0218]
53.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至23中任一项所述的化合物及药学上可接受的载剂以用于nafl、nash或nafld相关的肝纤维化的方法中。
[0219]
54.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至23中任一项所述的化合物及药学上可接受的载剂以用于nash的方法中。
[0220]
55.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至23中任一项所述的化合物及药学上可接受的载剂以根据实施方案28至39中任一项使用。
[0221]
56.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至23中任一项所述的化合物及药学上可接受的载剂以用于预防或nas评分为至少4的患者的nash，任选与肝纤维化(例如，晚期肝纤维化)相关的nash的方法中。
[0222]
57.一种或预防有需要的患者的代谢性肝脏疾病的方法，其包括向该患者施用有效量的根据实施方案1至23中任一项所述的化合物。
[0223]
58.一种有需要的患者的nash，尤其是与肝纤维化相关的nash的方法，其包括向该患者施用有效量的根据实施方案1至23中任一项所述的化合物。
[0224]
附图简要说明
[0225]
图1：a)dio小鼠的肝脂肪变性/肝脏三酸甘油酯的减少(实施例1)
[0226]
b)dio小鼠血浆alt/alt的降低
[0227]
进行单因素anova统计分析，随后进行dunnett多重比较检验。显著差异用星号表示(
**
，p《0.01，
***
，p《0.001)。
[0228]
图2：与用相同饮食的媒剂处理的对照动物相比，患有amln饮食诱导的nash的小鼠在八周内用剂量为80μg/kg、120μg/kg及160μg/kg(qd)的化合物5及剂量为400μg/kg qd的利拉鲁肽的效果。(实施例2)
[0229]
a)基线时及55天之后的体重
[0230]
b)在第56天终止之后的总体nafld活动性评分
[0231]
c)nafld活动性评分的变化(开始之前的预生检vs之后的生检)
[0232]
d)nafld活动性评分的变化(经媒剂校正)
[0233]
e)在研究结束时nafld活动性评分的组分(肝脏脂肪变性、小叶发炎、肝细胞气球样变(hepatocyte ballooning))
[0234]
f)纤维化评分的变化。
[0235]
实施例
[0236]
实施例1：对dio小鼠的脂肪肝的作用
[0237]
方法
[0238]
年龄为6-7周的雄性c57bl/6j小鼠获自charles river(sulzfeld，germany)。在到达动物设施后，任意向动物给予来自provimi kliba(kaiseraugst，switzerland)的粒状饮食编号3808，且动物自由获取自来水。一周之后，将动物置放于高脂肪饮食中，其中45％的可代谢能量来自脂肪(ssniff ef r/m acc.d12451(i)mod.；ssniffgmbh,soest,germany)。给予高脂肪饮食25周之后，将动物随机分成具有类似平均体重的组(第0天)。在研究中使用由保持标准低脂肪饮食(来自provimi kliba的饮食编号3808)的动物组
成的额外对照组(偏瘦对照组)。在开始化合物时，小鼠年龄为32至33周。
[0239]
所有动物每天接受两次皮下注射，第一次为在上午7am且第二次为在8h后的下午3pm。化合物5为每天在7am通过皮下注射给药一次，接着在8h后再进行媒剂注射。利拉鲁肽为每天在7am及3pm通过皮下注射给药两次。对照动物(给予高脂肪饮食或偏瘦对照组)每天接受媒剂注射(25mm pbs)两次。每天在上午给药之前测量体重。第一次给药发生在第1天，最后一次给药发生在第28天。在第29天进行最终血液取样之后立即通过颈椎脱位术处死动物。使用来自肝脏左外叶的约100mg等分试样来测量肝脏三酸甘油酯。
[0240]
使用自动化临床分析仪(cobas integra 400plus；roche diagnostics,mannheim,germany)来测量血浆中的alt(丙氨酸-氨基转移酶)。为测定肝脏三酸甘油酯，使用fastprep试管(mp biomedicals)用1ml异丙醇萃取来自左外叶的100mg组织。使用自动化临床分析仪(cobas integra 400plus；roche diagnostics,mannheim,germany)来测量上清液中的三酸甘油酯。
[0241]
结果
[0242]
在研究结束时，在12h禁食之后的第29天测量肝脏脂肪(图1a)。在与偏瘦对照组(53mg/g肝脏)进行比较时，给予高脂肪饮食的经媒剂处理的动物的平均肝脏三酸甘油酯含量指示肝脏脂肪变性(203mg/g肝脏)。在用10及30nmol/kg qd的化合物5(分别为40μg/kg及120μg/kg)之后，肝脏三酸甘油酯显著减少63mg/g及-146mg/g。利拉鲁肽(10nmol/kg bid，40μg/kg bid)使肝脏三酸甘油酯减少-27mg/g，其显著小于10nmol/kg qd剂量的化合物5。总体而言，与利拉鲁肽相比，化合物5展示降低肝脏三酸甘油酯的更大作用。
[0243]
当与偏瘦对照组(38u/l)进行比较时，主要在肝脏中表达的转氨酶alt在给予高脂肪饮食的经媒剂处理的动物的血浆中展示强烈升高的平均含量(404u/l；图1b)，从而表明此dio小鼠模型中的脂肪变性诱导的肝细胞损坏。在用10及30nmol/kg qd的化合物5后，alt显著减少250u/l及-347u/l。利拉鲁肽使alt减少-188u/l，其显著小于10nmol/kg qd剂量的化合物5。化合物5对血浆中alt的更显著减少伴随其相比于利拉鲁肽对肝脏三酸甘油酯的较大减少。
[0244]
实施例2：鼠类饮食诱导的nash模型中的功效
[0245]
方法
[0246]
在nash的小鼠模型(鼠类饮食诱导的nash模型)中研究化合物5及利拉鲁肽，如kristiansen等人(world journal of hepatology 2016,第8卷,第673-684页)中所描述。向c57bl/6j小鼠任意给予含高脂肪(40％，其中18％为转化脂肪)、碳水化合物(40％，其中20％为果糖)及胆固醇(2％)的饮食(d09100301，research diet，united states)，该饮食先前已描述为amln饮食(clapper等人,am j physiol gastrointest liver physiol 2013,第305卷,第g483-g495页)。对照组保持规律的啮齿动物食物(altromin 1324,brogaarden,denmark)。给予该饮食26周之后，进行肝脏以对基线处的nash及纤维化进行组织学评估。为此目的，通过吸入麻醉使用异氟醚(2-3％)使小鼠麻醉。在中线进行小腹切开术且暴露肝脏的左外叶。自肝叶远程部分切除肝脏组织的锥形楔形物(大致50mg)且将其固定在10％中性缓冲福尔马林(4％甲醛)中以进行组织学保存。立即使用双极性凝结(erbe vio 100电刀)对肝脏的切割表面进行电凝。将肝脏返回至腹腔，缝合腹壁，且用缝合器(stapler)来缝合皮肤。对于术后恢复，小鼠在op日及op后第1天及第2天接受皮下施用的卡
洛芬(carprofen)(5mg/kg)。
[0247]
对于组织学评估，将具有石蜡包埋的切片的载片在二甲苯中进行脱蜡且在分级乙醇系列中复水。对于苏木精与曙红(h&e)染，将载片在mayer氏苏木精(dako)中培育，在自来水中洗涤，在曙红y溶液(sigma-aldrich)中染，水合，用pertex安放且接着在扫描之前使其干燥。对于天狼星红染，将载片在weigert氏铁苏木精(sigma-aldrich)中培育，在自来水中洗涤，在天狼星红(sigma-aldrich)中染且在酸化水中洗涤两次。通过振荡载片来移除过量的水且随后将载片在三次更换的100％乙醇中水合，在二甲苯中清除且用pertex安放，且在扫描之前使其干燥。
[0248]
由对研究不知情的病理学家进行组织学评分。根据kleiner等人(hepatology 2005,第14卷,第1313-1321页)概述的临床准则确定nafld活动性评分及纤维化评分。
[0249]
根据体重及纤维化程度，将动物随机分为不同组。期为八周，在此期间动物保持给予amln饮食。通过每天一次皮下注射给予化合物。包括给予amln饮食的经媒剂处理的动物及给予规律的啮齿动物食物的未处理动物为对照组。各组大小在10与14只动物之间。
[0250]
后，收集终末肝脏样品且分析以进行预生检。
[0251]
结果
[0252]
在饮食诱导的nash模型中研究化合物5(日剂量为80/kg、120μg/kg及160μg/kg)及利拉鲁肽(日剂量为400μg/kg)。在基线下，给予amln饮食26周之后，动物体重在38与40g之间且显著高于偏瘦对照组但在组之间并无显著差异。8周之后，在所有剂量的化合物5及利拉鲁肽下达成相对于媒剂类似程度的显著体重减轻。体重在120μg/kg qd(32.0g)或160μg/kg qd(31.2g)的化合物5与利拉鲁肽(33.8g)之间显著不同(图2a)。
[0253]
8周之后，相比于媒剂组(6.2)，所有剂量的化合物5及利拉鲁肽下的nafld活动性评分(nas)显著较低。120μg/kg qd(3.3)或160μg/kg qd(3.2)的化合物5的平均秩显著低于利拉鲁肽组的平均秩(4.1)(图2b)。相比于经媒剂处理的动物，用所有剂量的化合物5或利拉鲁肽也导致nas相对于基线的显著提高(图2c)。尽管媒剂组中nas增加0.9分，但在80、120及160μg/kg qd的化合物5下，其分别降低2.0分、2.5分及2.4分。用利拉鲁肽降低1.8分与用化合物5达成的nas基线减少并无统计学差异。经媒剂校正的nas基线变化示于图2d中。
[0254]
nas的个别组分(脂肪变性、发炎及肝细胞气球样变评分)示于图2e中。8周之后，经媒剂处理的动物中的脂肪变性评分为3，而在80、120及160μg/kg qd剂量的化合物5下，其显著降低至1.5、1.3及1.2。利拉鲁肽使脂肪变性评分显著减少至2.1。值得注意的是，用化合物5达成的所有降低相对于利拉鲁肽的疗效是统计学显著的。经媒剂处理的动物中的发炎评分为2.3，且其为适度地且通过所有剂量的化合物5并未统计学上显著地减少至2。利拉鲁肽使发炎评分显著减少至1.9。然而，化合物5及利拉鲁肽对发炎评分的作用彼此并无统计学差异。经媒剂处理的动物中的气球样变评分的平均秩为0.9。在用任何剂量的化合物5的动物(气球样变评分0)中及仅在用利拉鲁肽的极少动物(气球样变评分0.1)中未检测到气球样变细胞，其中化合物5与利拉鲁肽之间无统计学差异。
[0255]
纤维化评分在经媒剂处理的动物中适度地增加0.2，而其在80μg/kg qd的化合物5下保持不变且在120及160μg/kg qd的化合物5下显著降低0.1及0.2。用利拉鲁肽的纤维化
评分的基线变化为0.1且与用化合物5所见的降低并无显著不同(图2f)。
[0256]
结果显示本发明的双重glp-1/升糖素受体激动剂的代表性实施例极大地减少dio-nash小鼠的体重及nas。nafld活动性评分的提高主要通过肝脂肪变性的改善驱动。体重及肝脂肪变性的减轻相比于利拉鲁肽更明显。
[0257]
实施例3：药物动力学参数的估计
[0258]
在向汉/韦斯大鼠(han/wistar rat)静脉内给药之后，测定测试化合物的药物动力学参数。还出于比较的目的测试酰化glp-1类似物索马鲁肽。
[0259]
自charles river(germany)获得雄性韦斯大鼠，在到达测试设施处时称重大约180至210g。将大鼠关在iv型欧洲标准大鼠笼具内，其中光周期为12小时黑暗及12小时光明。在研究期间，将大鼠圈养在iii型标准大鼠笼具中。在整个实验阶段期间任意施用饮食altromin 1324(altromin,germany)及水。将动物圈养在测试设施中至少4天以确保恰当的环境适应。
[0260]
首先将化合物溶解于0.1％氨水中以达至2mg/ml的标称浓度，且随后在含有25mm磷酸盐缓冲液的无菌pbs，ph 7.4中稀释至所需给药强度(10μm)。经由侧尾静脉进行对应于20nmol/kg的静脉内注射。
[0261]
在给药后的时间点0.08、0.25、0.5、1、2、4、8、24、32及48小时自眶周神经丛收集血液样品(200μl)至k3edta管中且在取样的20分钟内在4℃下离心5分钟。将血浆样品(》100μl)转移至96-孔pcr盘中，立即冷冻且保持在-20℃下直至使用lc-ms/ms分析各glp-1-升糖素化合物的血浆浓度。通过使用toxkintm 3.2版本(unilog it services)的非隔室模型方法分析个别的血浆浓度-时间概况且测定所得药物动力学参数。参见表4。
[0262][0263]
表4.
[0264]
实施例4：用以评估多种皮下(s.c.)剂量的化合物5在患有nash及纤维化的患者中的功效、安全性及耐受性的临床试验方案大纲
[0265]
试验指标
[0266]
主要指标为基于患有nash(nas≥4，纤维化f1-f3)的患者在48周之后的肝活组织检查，肝脏组织学发现相对于基线的改良(是/否)。
[0267]
组织学发现的改良定义为以下的组合：
[0268]
nash的改善：
[0269]
nas减少至少两分，其中小叶发炎或气球样变的nas子项评分减少至少一分，及
[0270]
纤维化无恶化，定义为不存在纤维化阶段的任何增加
[0271]
次要功效指标包括：
[0272]-肝脏脂肪含量的提高(是/否)定义为通过磁共振成像质子密度脂肪分数测量(mri-pdff)评估，48周之后的肝脏脂肪含量相比于基线的至少30％相对减少
[0273]-通过mri-pdff评估，48周之后的肝脏脂肪含量相对于基线的绝对及相对变化
[0274]-纤维化的改善(是/否)定义为通过肝活组织检查评估，纤维化阶段在48周之后降低至少一个阶段
[0275]-通过肝活组织检查评估，nas在48周之后相对于基线的绝对变化
[0276]
试验设计
[0277]
多中心、随机、剂量范围确定、双盲、安慰剂对照、平行组试验
[0278]
随机化患者的总数目
[0279]
240名患者
[0280]
各组的患者数目
[0281]
60名患者给予化合物5：2.4mg(第1组)
[0282]
60名患者给予化合物5：4.8mg(第2组)
[0283]
60名患者给予化合物5：6.0mg(第3组)
[0284]
60患者给予安慰剂(第4组)
[0285]
诊断
[0286]
非酒精性脂肪肝炎(nash)及纤维化
[0287]
主要的纳入及排除准则
[0288]
纳入准则：
[0289]-在签署同意书时≥18岁(或国家中超过18岁法定年龄者)且≤80岁的男性或女性患者。
[0290]-诊断有通过在筛检期间实施的生检，或通过在随机化之前的最后6个月内实施的历史生检证实的nash(nas≥4，其中发炎及气球样变各为至少1分)及纤维化阶段f1-f3，及稳定体重，其定义为小于5％自身报导的历史生检与随机化之间的体重变化(使用历史生检时)。
[0291]-在筛选问诊时通过mri-pdff测量的肝脏脂肪分数≥8％及通过测量的肝脏硬度》6.0kpa(若在筛检期间安排生检，则必须在生检之前进行mri-pdff及评估)。
[0292]-愿意且能够如研究者所判断根据方案进行肝活组织检查的患者。
[0293]-在第1次问诊时bmi≥25kg/m2且体重≥70kg。
[0294]
排除准则：
[0295]-当前大量饮酒或大量饮酒史(定义为在超过3个月的连续时段内平均男性摄入》210公克/周且女性摄入》140公克/周)或基于研究者判断不能可靠地定量过去5年内的饮酒。
[0296]-在第1次问诊之前的12周内服用历史上与肝脏损伤、肝脏脂肪变性或脂肪肝炎相关的药物。服用限制药物或考虑有可能干扰试验的安全实施的任何药物。
[0297]-具有其他形式的慢性肝脏疾病的病史(例如，病毒性肝炎、自体免疫性肝病、原发性胆管硬化症、原发性硬化性胆管炎、威尔森氏病(wilson's disease)、血沉着病、a1at缺乏症、肝脏移植病史)。
[0298]-在筛选之前5年内疑似、诊断或有肝细胞癌(hcc)病史，或有任何经记载的活动性
或疑似恶性疾病或恶性疾病史，除经适当的皮肤的基底细胞癌或子宫颈的原位癌外。
[0299]-诊断有严重或不稳定疾病，包括肝病(除nash以外)、肾病、胃肠道疾病、呼吸道疾病、心脏血管疾病(包括缺血性心脏病)、内分泌性疾病、神经性疾病、精神病、免疫性疾病或血液学疾病，及在研究者的临床判断中有可能干扰此试验中的安全性及功效分析的其他病状。还排除具有器官移植病史(除角膜移植之外)的患者及预期寿命小于2年的患者。
[0300]
测试产品
[0301]
化合物5的注射用溶液：0.6mg/ml、1.8mg/ml、3.6mg/ml、4.8mg/ml及6.0mg/ml预填充注射器，0.5ml填充体积
[0302]
剂量
[0303]
第1组：起始剂量为0.3mg，接着剂量递增达至维持剂量2.4mg，每周一次两个预填充注射器
[0304]
第2组：起始剂量为0.3mg，接着剂量递增达至维持剂量4.8mg，每周一次两个预填充注射器
[0305]
第3组：起始剂量为0.3mg，接着剂量递增达至维持剂量6.0mg，每周一次两个预填充注射器
[0306]
给药模式：皮下(subcutaneous，s.c.)
[0307]
参比产品：第4组：安慰剂
[0308]
剂量：匹配
[0309]
给药模式：皮下
[0310]
持续时间
[0311]
48周由长达24周的剂量递增时间段及至少24周的维持时间段组成

技术特征：

1.一种化合物，其具有通式ir-h-x2-qgtftsdyskyl-x15-x16-x17-x18-akdfi-x24-wle-x28-a-nh2(i)其中r选自h、c
1-4
烷基及乙酰基；x2选自aib及ac4c；x15选自asp及glu；x16选自glu及ψ；x17选自arg及ψ；x18选自ala及arg；x24选自glu及ψ；x28选自ser及ψ；其中所述化合物含有一个且仅一个ψ且其中所述ψ为lys的残基，其中侧链的氨基与选自由以下组成的组的取代基共轭hooc-(ch2)
16-(co)-isoglu-peg3-peg3-，及hooc-(ch2)
16-(co)-isoglu-gsgsgg-，其用于预防或代谢性肝脏疾病的方法中。2.根据权利要求1所述的根据权利要求1使用的化合物，其中x24为ψ。3.根据权利要求1所述的根据权利要求1使用的化合物，其中ψ为lys(-ggsgsg-isoglu-(co)-(ch2)
16-cooh)。4.根据权利要求1所述的根据权利要求1使用的化合物，其中所述化合物为选自由以下组成的组h-h-aib-qgtftsdyskyld-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-peg3-peg3)-raakdfiewlesa-nh2(化合物1)，h-h-aib-qgtftsdyskylderaakdfi-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-gsgsgg)-wlesa-nh2(化合物2)，h-h-ac4c-qgtftsdyskylde-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-peg3-peg3)-rakdfiewlesa-nh2(化合物3)h-h-aib-qgtftsdyskyle-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-gsg sgg)-raakdfiewlesa-nh2(化合物4)，h-h-ac4c-qgtftsdyskylderaakdfi-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-gsgsgg)-wlesa-nh2(化合物5)，h-h-ac4c-qgtftsdyskylderaakdfiewle-k([17-羧基-十七酰基]-isoglu-gsgsgg)-a-nh2(化合物6)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的根据权利要求1使用的化合物，其中所述疾病为nafld(非酒精性脂肪肝疾病)。6.根据权利要求1至4中任一项所述的根据权利要求1使用的化合物，其中所述疾病为nafl(非酒精性脂肪肝)、nash(非酒精性脂肪肝炎)、nafld相关的肝纤维化或nafld相关的肝硬化。7.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其用于nash，尤其是与肝纤维化相
关的nash的方法中。8.根据权利要求1至4中任一项所述的根据权利要求7使用的化合物，其中患者经诊断为具有至少4的nas(nafld活动性评分)且任选具有肝纤维化。9.根据权利要求1至4中任一项所述的根据权利要求8使用的化合物，其中所述nas中的至少1分各由气球样变(ballooning)及发炎分项评分(subscore)引起。10.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的化合物及药学上可接受的载剂，用于预防或代谢性肝脏疾病的方法中。11.根据权利要求10所述的根据权利要求10使用的药物组合物，其中所述疾病为nafld。12.根据权利要求10所述的药物组合物，其用于nash，尤其是与肝纤维化相关的nash的方法中。13.根据权利要求10所述的根据权利要求12使用的药物组合物，其中患者诊断为具有至少4的nas且任选具有肝纤维化。14.一种预防或有需要的患者的代谢性肝脏疾病的方法，其包括向所述患者施用有效量的具有通式i的化合物。15.一种在有需要的患者中nash、尤其是与肝纤维化相关的nash的方法，其包括向所述患者施用有效量的具有通式i的化合物。