[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1491964A [43]公开日2004年4月28日
[21]申请号02145913.4[21]申请号02145913.4
[22]申请日2002.10.23[71]申请人中国科学院过程工程研究所
地址100080北京市海淀区中关村北二条1号
[72]发明人苏志国 路秀玲 金业涛 赵东旭 [74]专利代理机构北京律诚同业知识产权代理有限公司代理人王凤华
[51]Int.CI 7C07K 14/805C07K 1/14
权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 3 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明提供了一种纯化血红蛋白的方法。本方
通过床层，血红蛋白被介质吸附，实现从人或牛、
猪、羊等动物的血红细胞裂解液中直接纯化血红蛋
白。该技术省去离心或过滤去除碎片步骤，仅一步
操作产品即达电泳纯，操作时间短，提取收率高，
产品活性损失小，是一种简捷、高效、适合工业化
生产的天然血红蛋白制备方法。
02145913.4权 利 要 求 书第1/1页 1.一种纯化血红蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)床层平衡：用pH值为5.0～8.0的平衡液缓冲液以2～5cm/min-1的线流速自下而上平衡扩张床吸附介质，直至扩张床层稳定后；其中扩张床吸附介质为粒径分布在50～300μm之间的阳离子交换介质或金属亲和层析介质；
(2)进料吸附：将红细胞裂解液pH值调成5.0～8.0，以2～5cm/min -1
的线流速自下而上进料，进料过程中注意保持适当高度和空隙率；
(3)淋洗：进料完毕后，保持床层扩张状态，用pH值为5.0～8.0的平衡液缓冲液以2～5cm/min-1的线流速自下而上洗去滞留在床层中未结合的蛋白、细胞碎片等杂质和其它与介质结合不牢的物质；
(4)改变pH值洗脱：将床层改为固定床操作，在2～20℃温度情况下，用pH值为6.0-8.0的平衡缓冲液以2～5cm/min-1的线流速自上而下流过床层，收集样品，整个纯化过程控制在2-20℃。
2.如权利要求1所述的纯化血红蛋白的方法，其特征在于步骤4)之后包括5)高盐洗脱：用含有0.5～1.5mol/L-1钠盐的平衡缓冲液自上而下继续洗脱与介质结合较牢的物质；6)介质再生：用5～10倍扩张床体积的0.01～0.5mol/L-1碱溶液，优选为NaOH溶液冲洗介质。
3.如权利要求1所述的纯化血红蛋白的方法，其特征在于所述的平衡缓冲液可以是P B S，钠-盐酸或乙酸-乙酸钠缓冲液。
4.如权利要求1所述的纯化血红蛋白的方法，其特征在于所述的平衡缓冲液盐浓度为10～80mmol/L-1。
5.如权利要求1所述的纯化血红蛋白的方法，其特征在于所述的金属亲和层析介质优选为固定了二价金属的亲和层析介质。
6.如权利要求5所述的纯化血红蛋白的方法，其特征在于所述的二价金属为Cu2+、Zn2+、或Ni2+。
7.如权利要求1所述的纯化血红蛋白的方法，其特征在于血红细胞裂解液来源于人或牛、猪、羊的血液。 02145913.4说 明 书第1/8页
一种纯化血红蛋白的方法
技术领域
本发明属于蛋白质分离纯化领域，尤其涉及一种采用扩张床吸附技术从动物的血红细胞裂解液中直接纯化血红蛋白的方法。 背景技术
人血液代用品是国际科学界及企业界关注的研究热点和难点，世界各主要发达国家都将其列入跨世纪的重大项目。尤其近二十年，对天然血液供应安全性的焦虑以及预期的高回报潜力激起了人们对开发血液代用品的极大兴趣。目前所研究的人血液代用品可大致分为三大类：全氟碳化合物，基于血红蛋白的血液代用品和通过血型转换而成的红细胞。其中由于全氟碳化合物不具备天然血红蛋白的生物学载氧特性，其研究与开发已不再是重点；通过血型转换成的红细胞具有贮存期短、不易运输等缺点，其研究与应用也受到极大的限制；基于血红蛋白的血液代用品由于具有天然血红蛋白的载氧、运输CO2和调节血液pH的功能，倍受研究人员关注，成为血液代用品研究的重点。
血红蛋白(Hb)存在于血红细胞中，血红细胞破裂可得到血红蛋白溶液。血液代用品的临床用量较大，其溶液中所残留的微量杂蛋白可能在患者体内形成抗体，并引发免疫反应。因此要尽量清除各种杂蛋白及其他杂质，产品纯度要求达到几乎100％。所以，高效分离纯化工艺是基于血红蛋白的血液代用品产业化的关键技术之一。 文献中已有的血红蛋白分离方法包括离心、透析、吸附等方法，都涉及两个以上步骤，其中至少有一步固液分离，即分离红细胞碎片和血红蛋白。1993年Shorr发展的膜过滤一层析法是迄今报道的制备血红蛋白的较好方法(Shorr，R.G.Process for hemoglobin extraction and purification.US Patent 5,264,555.1993.)。但该法具有膜污染和浓度极化问题，且膜分离过程耗时较长，
从而增加了成本和污染的机会。目前，血红蛋白的分离纯化技术大都只适合实验室或小规模
制备，因此有必要开发新的高效大规模制备血红蛋白的方法。 发明内容
本发明的目的是提供一种简捷、高效的从人或动物新鲜血红细胞中大规模分离纯化血红蛋白的方法。
本发明提供的利用扩张床吸附技术(也称膨胀床吸附技术)从动物的血红细胞裂解液中直接纯化血红蛋白的方法包括如下步骤(如图1所示)：
1)床层平衡：用pH值为5.0～8.0的平衡液缓冲液以2～5cm/min-1 的线流速自下而上平衡扩张床吸附介质，直至扩张床层稳定；
2)进料吸附：将红细胞裂解液pH值调成5.0～8.0，以2～5cm/min-1 的线流速自下而上进料，进料过程中注意保持适当高度和空隙率；
3)淋洗：进料完毕后，保持床层扩张状态，用pH值为5.0～8.0的平 衡液缓冲液以2～5cm·min-1的线流速自下而上洗去滞留在床层中 未结合的蛋白、细胞碎片等杂质和其它与介质结合不牢的物质；
4)改变pH值洗脱：将床层改为固定床操作，用pH值为6.0-8.0的平 衡缓冲液以2～5cm·min-1的线流速自上而下流过床层，收集样品。 整个纯化过程控制在2～20℃。
所述的扩张床吸附介质为粒径分布在50～300μm之间的阳离子交换介质或金属亲和层析介质。优选离子交换介质为：Sepharose Big Beads(Amersham Bioscience Biotech)、Spherosil(Biosepra.Inc)、Streamline SP(Amersham Bioscience Biotech)。金属亲和层析介质优选为固定了二价金属的亲和层析介质；进一步优选固定了Cu2+、Zn2+、或Ni2+等金属离子的亲和层析介质。金属亲和层析介质优选STREAMLINE 介质(Pharmcia公司)。
优选在步骤4)之后还可进一步包括步骤5)高盐洗脱和步骤6)介质再生：5)高盐洗脱：用含有0.5～1.5mol/L-1钠盐的平衡缓冲液自上而下继续洗脱与介质结合较牢的物质；6)介质再生：用5～10倍扩张床体积的0.01～0.5mol/L-1碱溶液，优选为NaOH溶液冲洗介质。
优选平衡缓冲液可以是PBS(K2HPO4/NaH2PO4)，钠-盐酸，乙酸-乙酸钠缓冲液等；优选平衡缓冲液的盐浓度为10～80mmol/L-1。
优选步骤5)中的钠盐为NaCl或Na2SO4。
所述的血红细胞裂解液来源于人或牛、猪、羊等动物的新鲜血液，得到的血红细胞裂解液直接用于纯化血红蛋白。
本发明提供的直接从红细胞提取纯化血红蛋白的新方法，其特征在于裂解红细胞后，不经过离心、过滤
或其它膜分离过程除细胞碎片，而直接采用扩张床吸附技术，以自下而上的进料方式使层析介质膨胀扩张，这不同于现有的吸附技术纯化血红蛋白。现有的吸附采用自上而下的进料方式，固体吸附介质压积在一起，不能直接用于吸附带固体的料液。本发明采用自下而上的进料方式，使吸附介质处于悬浮状态，颗粒之间存在较大空隙，使得料液中的固体能够通过。因此利用本发明，能够将含有细胞碎片、杂蛋白、血红蛋白的红细胞裂解液直接引入吸附柱，细胞碎片、杂蛋白直接通过，血红蛋白被介质吸附，实现从人或牛、猪、羊等动物的血红细胞裂解液中直接纯化血红蛋白。 实验证明，该技术省去离心去除碎片步骤，有效地控制了纯化过程中无载氧能力的高铁血红蛋白的生成，仅需一步操作，产品纯度达电泳纯，高铁血红蛋白含量不高于5.4％，与现有的较理想的膜过滤一层析纯化方法相比，扩张床吸附法操作时间短，提取收率高，产品活性损失小，是一种简捷、高效、适合工业化生产的天然血红蛋白制备方法。Shorr等人的膜过滤-层析法和本发明扩张床纯化血红蛋白的比较见表1。
表1
本发明扩张床吸附法 膜过滤-层析法
层析介质 强阳离子层析介质或金 弱阴离子层析介质
属亲和层析介质
吸附对象 血红蛋白 料液中少量杂质
消耗时间(h) 2 6
SDS-PAGE电泳图谱 电泳一条带，达电泳纯 含微量杂蛋白
高铁血红蛋白含量 5.4％ 8％
(W/W)(无活性)
平均收率(％) 85.7 77.4
豫公网安备41160202000603
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