(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010965886.9
(22)申请日 2020.09.15
(71)申请人 上海英基生物科技有限公司
地址 201100 上海市闵行区园美路58号2幢
4层、5层
(72)发明人 冯延叶 李艳玲 高伟 赖煦卉
孙大鹏
(74)专利代理机构 湖北天领艾匹律师事务所
42252
代理人 杨建军
(51)Int.Cl.
C40B 50/06(2006.01)
C12Q 1/6806(2018.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种DNA和RNA共建库的方法
及试剂盒，涉及生物技术领域。所述方法，包括以
下步骤：1)RNA片段化及DNA的变性；2)一链cDNA
的合成及链置换反应；3)DNA 3'接头连接；4)文
库扩增。所述试剂盒包含：工具酶、工具酶反应体
系、接头体系、PCR反应体系以及Low ‑EDTA ‑TE。本
打破了常规的建库手段，规避了必须DNA和RNA分
别建库的繁琐操作，
有效的节省成本。
权利要求书1页 说明书14页序列表1页 附图6页CN 112176420 A 2021.01.05
C N 112176420
A
1.一种DNA和RNA共建库的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.对RNA和DNA混合样本进行RNA片段化及DNA变性； S2.基于S1的产物，利用随机引物进行DNA的链置换反应，将DNA片段带上5'接头，形成5'Truncted Adapter -DNA；将RNA逆转录成一链cDNA，带上5'接头，形成5'Truncted Adapter -cDNA；
S3.使用外切酶对多余的引物进行消化，再利用磁珠对产物进行纯化；
S4.对带5'接头的DNA及带有5'接头的一链cDNA的3'末端添加一段多聚寡核苷酸PloyC，得到5'Truncted adapter -DNA -多聚寡核苷酸结构，利用DNA修复酶、DNA聚合酶及DNA连接酶将所述5'Truncted Adapter -DNA -多聚寡核苷酸的3'末端和P7接头连接；
S5.通过PCR文库扩增，得到上机测序文库。
2.根据权利要求1所述的DNA和RNA共建库的方法，其特征在于，所述步骤S1包括对混合样本中的DNA进行片段化。
3.根据权利要求1所述的DNA和RNA共建库的方法，其特征在于，所述随机引物为T5 Truncted Adapter+N6，所述随机引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.根据权利要求1所述的DNA和RNA共建库的方法，其特征在于，所述步骤S2在Klenow (exo -)聚合酶和逆转录酶及RNA Inhibitor条件下进行一链cDNA的合成及链置换反应。
5.根据权利要求1所述DNA和RNA共建库的方法，其特征在于，所述步骤S3使用Exo I外切酶对残留引物进行消化。
6.根据权利要求1所述的DNA和RNA共建库的方法，其特征在于，所述P7接头为T7 Truncated Adapter。
7.根据权利要求1所述的DNA和RNA共建库的方法，其特征在于，所述逆转录酶为Hiscript II逆转录酶、Hiscript III逆转录酶、Hiscript IV逆转录酶中的一种；所述DNA 聚合酶选自Klenow(exo -)聚合酶、Bsu DNA聚合酶、phi29聚合酶、Taq聚合酶、A家族DNA聚合酶、B家族高保真聚合酶中的一种。
8.一种DNA和RNA共建库的试剂盒，其特征在于，包括如下组分：
1)工具酶：所述工具酶包括逆转录酶、末端转移酶、DNA修复酶、DNA聚合酶、DNA连接酶；
2)工具酶反应体系：各个工具酶对应的反应所需要的缓冲液；
3)接头体系：随机引物及T7 Truncated Adapter；
4)外切酶消化体系；
5)PCR反应体系；
6)Low -EDTA -TE。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述随机引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：
所述逆转录酶为Hiscript II逆转录酶、Hiscript III逆转录酶、Hiscript IV逆转录酶中的一种；
所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶及E.coli DNA连接酶中的一种；
所述聚合酶为Klenow(exo -)聚合酶、Bsu DNA聚合酶、phi29聚合酶、Taq聚合酶、A家族DNA聚合酶、B家族高保真聚合酶中的一种。
权 利 要 求 书1/1页CN 112176420 A
一种DNA和RNA共建库的方法及试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA和RNA同时构建测序文库的方法。
背景技术
[0002]目前针对不同的核酸样本是采用不同的建库策略。普通DNA样本首先经过末端修复及加A，然后进行接头连接，最后通过PCR扩增完成DNA测序文库的构建，耗时3h左右。普通RNA样本首先需要进行Poly(A)的捕获或者核糖体 RNA的去除，然后进行cDNA的合成，最后通过DNA样本建库策略完成RNA 测序文库的构建，耗时8h。宏基因组测序在新病原体的诊断、检测、跟踪及溯源起到关键的作用。传统的建库方式无法真正做到DNA和RNA样本共同建库，目前出现的一种DNA/RNA共建库的方法是：RNA经过oligo-dT引物反转录后， Tn5转座酶随机对RNA/DNA杂合链进行切割，在片段化之后，转座酶会在杂合链两端加上接头，之后进行PCR扩增。此种方法的核心点在于使用Tn5转座酶对RNA/cDNA复合双链和DNA双链进行打断和添加部分接头，该方法虽然可以很大程度上的优化了建库步骤，节省建库时间，但是Tn5转座酶打断建库依然存在着一些不可避免的缺陷：1)Tn5转座酶打断识别具有特异性，其测序的前9个bP有明显的偏好性，即使是突变的Tn5转座酶也无法完全消除bais；2) Tn5建库是酶量依赖型，对DNA的定量要求高，酶和DNA的比例不准确会影响打断；3)对DNA溶液杂质不耐受，会影响打断效果；4)Tn5建库无法适用于降解性的样本或者分子片段较小的核酸。
[0003]因此，有必要针对现有技术的缺陷，采用单链建库的原理，提出一种不同与Tn5转座酶建库的DN
A/RNA共建库的方法，简化建库流程，减少建库时间，同时也可以解决测序偏好性的问题，并能适应于降解样本和不同分子片段大小的核酸样本的新型高效共建库方法。
发明内容
[0004]针对现有技术的缺陷，本发明基于单链建库的原理，提出一种DNA和RNA 共建库的方法，以达到有效的简化建库流程，减少建库时间，解决测序偏好性的问题，也能适应于降解样本和不同分子片段大小的核酸样本的目的。
[0005]为了达到上述目的，本发明提出一种DNA和RNA共建库的方法，包括以下步骤：[0006] 1.对RNA和DNA混合样本进行RNA片段化及DNA变性；
[0007] 2.基于S1产物，利用随机引物进行DNA的链置换反应，将DNA片段带上5'接头，形成5'T r u n c t e d A d a p t e r-D N A；将R N A逆转录成一链c D N A，带上 5'接头，形成5' TrunctedAdapter-cDNA；
[0008] 3.使用外切酶对多余的引物进行消化，再利用磁珠对产物进行纯化；
[0009] 4.对带5'接头的DNA及带有5'接头的一链cDNA的3'末端添加一段多聚寡核苷酸PloyC，得到5'Truncted adapter-DNA-多聚寡核苷酸结构，利用DNA修复酶、DNA聚合酶及DNA连接酶将所述5'TrunctedAdapter-DNA-多聚寡核苷酸的3'末端和P7接头连接；
[0010] 5.通过PCR文库扩增，得到上机测序文库。
[0011]进一步地，所述步骤1中包括对混合样本中的DNA进行片段化。
[0012]进一步地，所述随机引物为T5 TrunctedAdapter+N6，所述随机引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0013]进一步地，所述步骤S2在Klenow(exo-)聚合酶和逆转录酶及RNAInhibitor 条件下进行一链cDNA的合成及链置换反应。
[0014]进一步地，所述逆转录酶为Hiscript II逆转录酶、Hiscript III逆转录酶、 Hiscript IV逆转录酶中的一种。
[0015]进一步地，所述步骤3使用Exo I外切酶对残留引物进行消化。
[0016]进一步地，所述DNA聚合酶选自Klenow(exo-)聚合酶、Bsu DNA聚合酶、 phi29聚合酶、Taq聚合酶、A家族DNA聚合酶、B家族高保真聚合酶中的一种。
[0017]本发明的另一目的在于，提供一种DNA和RNA共建库的试剂盒，包括如下组分：[0018]1)工具酶：所述工具酶包括逆转录酶、末端转移酶、DNA修复酶、DNA 聚合酶、DNA连接酶；
[0019]2)工具酶反应体系：各个工具酶对应的反应所需要的缓冲液；
[0020]3)接头体系：随机引物及T7 TruncatedAdapter；
[0021]4)外切酶消化体系；
[0022]5)PCR反应体系；
[0023]6)Low-EDTA-TE。
[0024]进一步地，所述随机引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0025]进一步地，所述逆转录酶为Hiscript II逆转录酶、Hiscript III逆转录酶、 Hiscript IV逆转录酶中的一种；
[0026]进一步地，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶及E.coli DNA连接酶中的一种；
[0027]进一步地，所述聚合酶为Klenow(exo-)聚合酶、Bsu DNA聚合酶、phi29聚合酶、Taq 聚合酶、A家族DNA聚合酶、B家族高保真聚合酶中的一种。
[0028]与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0029]1)本发明实现了DNA/RNA样本同时完成测序文库的建库。打破了常规的建库策略，不依赖样本的完整性，适用于各种DNA及RNA样本建库。本发明可以用于宏基因测序，对病毒微生物等具有良好的实用性；
[0030]2)本发明实验步骤简单，用时短，可以有效的降低成本。
附图说明
[0031]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0032]图1是本发明一种DNA/RNA共建库的方法流程图；
[0033]图2是本发明一种DNA/RNA共建库的原理图；
[0034]图3是T7 TruncatedAdapter结构示意图；
[0035]图4是实施例1中RNA样本的建库的一链cDNA合成效率分析图；
[0036]图5是实施例1中RNA样本的文库制备示意图；
[0037]图6是实施例2中DNA样本的文库制备示意图；
[0038]图7是实施例3中DNA和RNA混合样本的文库制备示意图。
具体实施方式
[0039]以下实例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。[0040]本发明的建库原理为：通过对样本中RNA的打断及DNA变性，一链cDNA 合成及链置换反应、DNA 3'接头的连接并形成单链，通过PCR扩增快速地来实现RNA和DNA混合样本的建库。以达到有效的简化建库流程，减少建库时间，解决测序偏好性的问题，也能适应于降解样本和不同分子片段大小的核酸样本的目的，所述共建库的方法流程图如图1所示，所述建库的原理图如图2所示。
[0041]实施例1 RNA样本的建库
[0042]本实施例中，使用小鼠的50ng mRNA和大鼠的50ng mRNA分别进行建库测试，通过RNA片段化、一链cDNA合成及链置换反应、DNA 3'接头的连接及文库扩增完成RNA的建库，为了检测可靠性，每个样本设置了两个重复。
[0043]1)RNA的片段化：
[0044]配制反应体系如下：
[0045]
[0046]FragmentBuffer的组成是：320mM Tris-HCl，800mM KCl，240mM MgCl2，pH为7.9。运行反应程序：94℃/10min，4℃/hold。
[0047]2)链置换反应：
[0048]通过随机引物对片段化的RNA进行一链cDNA的合成。随机引物是在N6 的5'端加上T5 TrunctedAd
apter，引物序列是：
[0049]5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3'，使用的混合酶1st cDNA/ DNA Synthesis Enzyme Mix是：20U Klenow(exo-)，200U Script II RT，20U RNase Inhibitor。对照是没有在N6的5'端加上T5 TrunctedAdapter，引物序列是：5'-NNNNNN-3'。[0050]配制反应体系如下：
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