(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010453011.0
(22)申请日 2020.05.25
(71)申请人 浙江中创生物医药有限公司
地址 325000 浙江省温州市瓯海区东方南
路38号国家大学科技园9号楼401室
(72)发明人 丁春明 金胜男 朱德雯 栾菊
(74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公
司 72001
代理人 李波 梅黎
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6886(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及结直肠癌DNA甲基化的检测方法
及试剂。具体地，本发明涉及通过检测来自所述
判断所述DNA的甲基化水平来诊断受试者中是否
存在肠癌、判断患有肠癌的受试者术后的预后、
预测患有肠癌的受试者术后复发或评估对患有
肠癌的受试者的效果的方法。本发明还涉及
用于所述方法的标志物、
试剂盒和检测试剂。
权利要求书2页 说明书75页序列表26页 附图17页CN 112159844 A 2021.01.01
C N 112159844
A
1.诊断受试者中是否存在结直肠癌、判断患有结直肠癌的受试者术后的预后、预测患有结直肠癌的受试者术后复发或评估对患有结直肠癌的受试者的效果的方法，包括检测来自所述受试者的样本中的游离DNA中的甲基化标志物以判断所述DNA的甲基化水平，如果所述甲基化水平高于正常对照样本的DNA甲基化水平，则确定所述受试者中存在结直肠癌、患有结直肠癌的受试者术后的预后不佳、患有结直肠癌的受试者术后容易复发或对所述受试者的效果不佳，所述甲基化标志物是选自表2、表3和表8所列标志物的一种或多种。
2.权利要求1的方法，其中所述甲基化标志物的检测是使用多重定量甲基化特异性PCR 进行的，并且所述甲基化标志物是：
1)选自MBSF9、MBSF10、MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8、MBSR9、MBSR11和MBSR16中的一种或多种；
2)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、MBSR16、NDRG4和QKI的一种或多种；
3)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、NDRG4、QKI、RD1和RD2的一种或多种；或
4)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、QKI、RD1和RD2的一种或多种；
任选地，所述多重定量甲基化特异性PCR中包括内参基因ACTB的测定。
3.权利要求2的方法，其中所述多重定量甲基化特异性PCR使用针对权利要求2所述甲基化标志物的引物和探针，以及针对内参基因ACTB的引物和探针，其中所述引物和探针包含如表4所示的序列或与表4所示序列具有至少80％序列同一性的序列。
4.权利要求3的方法，其中当甲基化标志物是选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、QKI、RD1和RD2的一种或多种时，多重定量甲基化特异性PCR中不使用RD2_F引物。
5.权利要求1的方法，其中所述甲基化标志物的检测是使用多重定量甲基化特异性PCR 进行的，在所述多重定量甲基化特异性PCR中，将甲基化标志物分为两组或更多组，针对每组标志物以及内参基因的探针各自使用不同的荧光标记。
6.权利要求5的方法，其中将甲基化标志物分为两组，第1组由MBSF9、MBSR16、MBSF8、MBSR13、NDRG4、NPY和QKI组成，并且第2组由MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8和MBSR9组成，并且使用内参基因ACTB，其中针对第1组标志物的引物和探针包含如表5所示的序列或与表5所示序列具有至少80％序列同一性的序列，针对第2组标志物的引物和探针包含如表6所示的序列
或与表6所示序列具有至少80％序列同一性的序列，并且针对内参基因ACTB的引物和探针包含如表7所示的序列或与表7所示序列具有至少80％的序列同一性。
7.权利要求1的方法，其中所述甲基化标志物的检测是使用核酸飞行质谱法进行的，并且所述甲基化标志物是选自RRB10、RRB13、RRB14、RRB16、RRB17_1、RRB17_2、RRB20、RRB21_ 4、RRB26_2、RRB2、RRB30、RRB6_1、RRB6_4和RRB6_5的一种或多种，任选地，所述核酸飞行质谱法包括内参基因ACTB的测定。
8.权利要求7的方法，其中所述核酸飞行质谱法使用针对所述甲基化标志物和内参基因的PCR引物和延伸引物并且同时扩增拷贝数已知的甲基化标志物的竞争物序列，根据甲基化标志物与竞争物的比值计算出甲基化标志物的拷贝数，
其中针对甲基化标志物和内参基因的PCR引物包含如表9所示的序列或与表9所示序列具有至少80％序列同一性的序列，针对甲基化标志物和内参基因的延伸引物包含如表10所示的序列或与表10所示序列具有至少80％序列同一性的序列，甲基化标志物和内参基因的
竞争物包含如表11所示的序列或与表11所示序列具有至少80％序列同一性的序列。
9.权利要求1-8的任一项的方法，其中所述样本选自体液、血液、血清、血浆、尿、唾液、汗液、痰、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊水、间质液、肺灌洗液、脑脊液、粪便和组织样本。
10.用于诊断受试者中是否存在结直肠癌、判断患有结直肠癌的受试者术后的预后、预测患有结直肠癌的受试者术后复发或评估对患有结直肠癌的受试者的效果的甲基化标志物，所述标志物选自表2、表3和表8所列标志物的一种或多种。
11.权利要求10的甲基化标志物，其选自MBSF9、MBSF10、MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8、MBSR9、MBSR11、MBSR16、MBSF8、MBSR13、RD1、RD2、NPY、NDRG4、QKI、RRB10、RRB13、RRB14、RRB16、RRB17_1、RRB17_2、RRB20、RRB21_4、RRB26_2、RRB2、RRB30、RRB6_1、RRB6_4和RRB6_5。
12.用于诊断受试者中是否存在结直肠癌、判断患有结直肠癌的受试者术后的预后、预测患有结直肠癌的受试者术后复发或评估对患有结直肠癌的受试者的效果的试剂盒，其中包含用于检测甲基化标志物的试剂，所述甲基化标志物是选自表2、表3和表8所列标志物的一种或多种。
13.权利要求12的试剂盒，其中所述甲基化标志物是选自MBSF9、MBSF10、MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8、MBSR9、MBSR11、MBSR16、MBSF8、MBSR13、RD1、RD2、NPY、NDRG4、QKI的一种或多种，并且任选地，所述试剂盒包含用于检测内参基因ACTB的试剂。
14.权利要求13的试剂盒，其中所述检测甲基化标志物和内参基因的试剂包含如表4所示的序列。
15.权利要求12的试剂盒，其中所述甲基化标志物是选自RRB10、RRB13、RRB14、RRB16、RRB17_1、RRB17_2、RRB20、RRB21_4、RRB26_2、RRB2、RRB30、RRB6_1、RRB6_4和RRB6_5的一种或多种，并且任选地，所述试剂盒包含用于检测内参基因ACTB的试剂。
16.权利要求15的试剂盒，其中所述检测甲基化标志物和内参基因的试剂包含如表9、表10和表11所示的序列或与表9、表10和表11所示序列具有至少80％序列同一性的序列。
17.权利要求13或14的试剂盒，其中所述甲基化标志物是：
1)选自MBSF9、MBSF10、MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8、MBSR9、MBSR11和MBSR16中的一种或多种；
2)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、MBSR16、NDRG4和QKI的一种或多种；
3)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、NDRG4、QKI、RD1和RD2的一种或多种二或
4)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、QKI、RD1和RD2的一种或多种。
18.多核苷酸，其包含与选自SEQ ID NOs：1、2和9-120的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。
结直肠癌DNA甲基化的检测方法及试剂
技术领域
[0001]本发明涉及医学诊断领域，具体设计结直肠癌的早期诊断、预后、疗效评估等。并且还涉及用于所述诊断、预后和疗效评估的试剂盒以及试剂。
背景技术
[0002]结直肠癌是世界范围内常见的消化道恶性肿瘤之一。据统计2018年结直肠癌新发患者约180万例，死亡人数约86万[1]。在我国结直肠癌发病率和死亡率均居于肿瘤类第5位[2]。但是近年来以美国为代表的发达国家的整体结直肠癌发病率已经开始下降[3]，而我国结直肠癌发病人数和死亡人数呈上升趋势[2]，这一增长变化值得关注并深入分析。一方面，高脂饮食、吸烟和酗酒等生活方式都可能会增加罹患结直肠癌的风险，因此I级预防能发挥35％的作用以减少癌症的发生。另外，九成以上的结直肠癌患者年龄超过50岁，他们经常忽视病变的早期症状，包括粪便带血或排便习惯的变化，导致确诊时肿瘤已发展至晚期，而晚期结直肠癌患者五年生存率不足15％，远低于早期患者的生存率。分析表明，在降低结直肠癌发病率上，美国通过开展结直肠癌早期筛查的II级预防发挥了53％的作用，而临床发挥了12％的作用[3]。
[0003]研究证实结直肠癌的发生是由一系列遗传和表观遗传学变异共同作用产生的[4]，包括抑癌基因的功能丧失缺陷，癌基因的功能获得缺陷等，这些变异会赋予细胞选择性生长优势，被认为是“驱动”事件，并推动细胞克隆增殖向恶性肿瘤发展。典型的散发性结直肠癌可能仅包含2-8个驱动基因变异，其余为基因组不稳定和随机事件导致的“乘客”基因缺陷，这使得每位患者的肿瘤在遗传和表观遗传学上都是独特的，这一点也是目前精准医疗考虑的重要因素。根据这些分子特征可将结直肠癌分为不同的亚型，它们之间呈现不同的表型和预后特征[5，6]。其中，在表观遗传学中研究较为深入的是DNA甲基化，具体机制是在基因组中通过DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)转移甲基基团到CpG二核苷酸胞嘧啶的5位碳原子上，使其变为5-甲基胞嘧啶[7]。DNA甲基化可能导致相关基因(包括肿瘤抑制基因)的转录抑制和表达沉默。DNA异常甲基化在肿瘤形成过程中频繁发生，相对于基因突变等遗传学变异，其具有发生于肿瘤早期，范围广、变异模式多样等特点，因此可作为诊断、预后评估、个体化等方面的肿瘤分子标志物[8]。[0004]患者的生存率和肿瘤发现的早晚相关，早发现是提高结直肠癌患者生存率和治愈率的关键。近几十年间，美国结直肠癌的发病率和死亡率总体呈下降趋势，主要归功于筛查的普及，目前美国结直肠癌筛查率达到60％；而我国由于筛查并未广泛开展，结直肠癌的早期诊断比例远低于欧美发达国家。现在临床可用的结直肠癌筛查方法包括粪便隐血实验(FOBT)、粪便免疫化学法检测(FIT)、结肠镜、Cologuard和EpiProcolon等，但这些方法各自有其优缺点，例如粪便隐血实验是一种非侵入性的检测方法，且操作简易，价格低廉，但敏感性较低，结果易受患者饮食、药物等因素影响；结肠镜检查是金标准，可检测整个肠道发生的病变并进行，但此方法
对肠道准备要求高，具有侵入性，存在出血、穿孔等胃肠道不良事件风险，患者依从性不高且许多地区无法广泛[9]。因此，开发一种无创的、较为灵敏
和特异的筛查方法是目前的研究热点。
[0005]当前对于结直肠癌患者的手段主要为手术及术后辅助化疗。然而，对于初始结束时认为已治愈的结直肠癌患者，在肿瘤切除后仍存在35％的复发率，其中80％出现于切除后2年内[10]，复发转移往往较迟被发现。此外，高危的患者(如III期结直肠癌患者)在手术后需要继续接受化疗以降低复发和转移的风险[11，12]，但并非所有的病人都可以获益。临床上常规用于术后残留灶评估和指导的指标是依据T、N、M系统对肿瘤进行分类，即肿瘤浸润深度(T)，淋巴结转移与否(N)，存在远处转移与否(M)。然而使用TNM分期对于部分II期和III期患者能提供的预测信息相对较弱。另外，在完成明确的后，临床建议进行随访监测以尽早发现复发转移然后及时，但是实际上许多复发事件发现较晚[13]，并且只有10％-20％的异时转移得到治愈[14]。目前常用的监测方法包括CT、内镜下活检等[15]，这些方法具有辐射性、侵入性、缺乏敏感性等缺点。癌胚抗原(CEA)是目前唯一推荐用于结直肠癌监测和预测的血液标志物[15]，但是其敏感性较低[16]。因此，寻非侵入性和高灵敏度的预后标志物，进行术后残留灶检测和准确的预后评估可以提供早期有效的，对于改善患者生存至关重要。
[0006]术前新辅助放化疗是结直肠癌综合的重要部分[17]，通过不同层次的，目的在于提高手术
切除率，提高保肛率，有望改善患者的无疾病生存率。在临床实践中，接受新辅助放化疗的局部进展期直肠癌患者，部分患者肿瘤退缩效果好，其预后也明显改善，但也有部分患者肿瘤退缩效果不明显，且承受了不必要的放化疗不良反应和手术延迟。目前，尚未有明确指标能预测放化疗敏感性。同时，放化疗后判断是否达到完全缓解也是一大难题，通过影像学、肠镜、肿瘤标志物及体格检查等手段的判断存在较大误差。在个体化的背景下，如何筛选合适的患者制定合理的新辅助方案及进行疗效评估有重要意义。[0007]随着分子生物学技术的不断发展，以检测血液中循环肿瘤细胞和游离核酸作为分子诊断标志物的液体活检技术得以实现且日益受到关注。在结直肠癌筛查方面，液态活检与肠镜、FIT等方法相比，兼具无创、简单经济、灵敏度高等特点，患者依从性更好，易于在人中推广以提高普查率。在结直肠癌诊断、评估预后疗效、动态监测方面，相对于诊断“金标准”组织活检方法，液态活检可以更全面地反映肿瘤特性、克服肿瘤异质性，无创且可进行多次取样，能及时监测肿瘤的动态变化及对的敏感性；而已有的血液蛋白类肿瘤标志物易受身体内环境影响，稳定性较差，且半衰期长，准确性受限，影像学检查手段灵敏度不够，往往在肿瘤发展至晚期才能分辨。因此液态活检在肿瘤的筛查、诊断、判断预后和转归、评价疗效以及高危人随访观察等方面都具有较大的实用价值，可以使结直肠癌患者得到及时合理的诊治，改善预后生存，临床意义重大[18，19，20]。外周血中存在细胞裂解释放的游离DNA(cfDNA，Cell-free DNA)，而cfDNA中包含的循环肿瘤DNA(ctDNA，Circulating tumor DNA)是指肿瘤细胞产生的释放入外周血的DNA片段，ctDNA半衰期短，且携带有基因突变、拷贝数异常和甲基化等信息，多项研究表明可用于结直肠癌肿瘤的筛查诊断、术后残留灶检测、复发监测、预后评估等[21]。
[0008]现有的Epi proColon检测产品是目前首个也是唯一获FDA批准的结直肠癌血液筛检产品。Epi proColon检测方法基于HeavyMethyl real-time PCR技术[22，23]，可同时在一个QPCR反应中检测1个目的基因SEPTIN9和1个内参基因ACTB。对血浆提取cfDNA进行亚硫酸氢盐转化(Bisulfite Conversion)，然后在QPCR反应体系中加入根据SEPTIN9基因和内参
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