(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201410849417.5
(22)申请日 2014.12.30
C12Q 1/68(2006.01)
C12N 15/11(2006.01)
(71)申请人宁波有成生物医药科技有限公司
地址315040 浙江省宁波市院士路66号创
业大厦532
(72)发明人邱英华 周细武
(54)发明名称
盒及检测方法
(57)摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种
采用荧光定量PCR 检测基因突变的方法，特别涉
及一种MyD88基因突变荧光定量PCR 检测试剂盒
及检测方法，可在突变含量只有0.1％的临床样
本中检测出低至5个拷贝的突变DNA。本发明的
量PCR 反应体系和设计反应条件；利用特异性引
物扩增样品中的突变基因靶序列；利用探针和扩
增产物的杂交，检测反应体系中FAM 和HEX 荧光信
号强度作为结果的判断标准。本试剂盒检测速度
快，只需90分钟即可完成检测。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页 附图1页
(10)申请公布号CN 104531875 A (43)申请公布日2015.04.22
C N 104531875
A
1.用于检测MyD88基因突变的特异性引物和探针，见本发明说明书表1，P-SEQ-1～
P-SEQ-22。
2.一种检测MyD88基因突变的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物和探针。
3.如权利要求2所述的检测MyD88基因突变的检测试剂盒，包括以下荧光定量PCR反应体系：
。
4.如权利要求2所述的检测MyD88基因突变的检测试剂盒，荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性5分钟后进入以下循环：72℃20秒，95℃15秒，65℃20秒，进行10个循环；72℃20秒，95℃15秒，60℃20秒，共35个循环，荧光信号收集温度设定在退火温度。 5.如权利要求2所述的检测MyD88基因突变的检测试剂盒，检测结果判定方法为：以HEX的信号达到设
定阈值(Ct<32)时表明样品DNA中包含MyD88基因，且上样量在允许范围内，说明FAM的信号可信、有效；以FAM信号达到设定阈值时所需的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，当Ct值等于0或≥35时，检测结果判定为阴性，Ct值＜32时，检测结果为阳性，Ct值介于32至35之间为临界值，需重新检测。
6.如权利要求2所述的检测MyD88基因突变的检测试剂盒，待检测样品包括新鲜病理组织、石蜡包埋病理组织、石蜡切片和血液。
7.一种用于检测MyD88基因突变的引物和探针，其特征在于，由P-SEQ-1～P-SEQ-22的寡核苷酸引物和探针或序列与其有至少70％同一性的寡核苷酸组成。
一种MyD88基因突变荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种采用荧光定量PCR检测基因突变的方法，特别涉及一种MyD88基因突变荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，可在突变含量只有0.1％的临床样本中检测出低至5个拷贝的突变DNA。
背景技术
[0002] MyD88(髓样分化因子88，myeloid differentiation factor 88)的相对分子量为35 kDa，包含2个特殊的结构域。其C端带有与TLR分子胞内段相同的TIR结构域，通过同型相互作用与TLR/IL-1R相接，启动信号转导；N端是死亡结构域(death domain，DD)，带有死亡结构域的信号分子，参与凋亡相关的信号通路，通过DD招募、结合并活化其他带有DD 的分子，如蛋白激酶IRAK，进而启动相关信号传导。MyD88作为一种衔接蛋白，可向细胞内传递信号，激活核因子-κB(NF-κB)等转录因子，引起多种炎性细胞因子以及抗凋亡分子的释放，从而参与人体固有免疫。目前一般认为该通路的过度激活与自身免疫疾病相关，近年来随着研究的深入，发现部分肿瘤细胞也表达有该信号分子，参与多种肿瘤的发病。[0003] 多项研究已在数种B细胞肿瘤中发现了MyD88第265位氨基酸由亮氨酸变成苯丙氨酸的突变(L265P)。此突变位点正好处于TLR结构域，可导致NF-κB信号通路的异常激活。Ngo等[1]通过RNA干扰、高通量mRNA测序发现29％的ABC分子亚型弥漫性大B细胞淋巴瘤存在MyD88 L265P突变，而在其他类型的弥漫大B细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤中极少或者没有。有研究认为NF-κB信号途径的持续激活可促进细胞恶性增殖，途径的持续过度激活是ABC型弥漫性大B细胞淋巴瘤的特征[2]。Treon等[3]发现超过90％的华氏巨球蛋白血症具有MyD88 L265P，这种突变体可以引发白介素-1受体相关激酶(interleuki n-1receptor-associated kinase，IRAK)介导的NF-κB信号的激活，促进细胞增殖。近年来的研究证实MyD88 L265P是IgM MGUS、华氏巨球蛋白血症常见的较为特异的基因突变，在疾病的诊断、病理机制及疗效评估方面均具有重要意义。
[0004] 弥漫性大B细胞淋巴瘤是成年人中最为常见的非霍奇金淋巴瘤，通过分子表型，可分为激活型(ABC)、生发中心型(GCB)、原发纵膈型(PMBL)等。其中ABC型预后最差，临床有效率不到40％。上述研究提示MyD88信号通路异常激活参与了B细胞肿瘤的发生，以MyD88信号通路为靶点的抑制剂可能成为B胞肿瘤的新手段。应用分子诊断技术准确地检测病人肿瘤细胞中MyD88基因突变状态，从而选择合适的靶向药物，不仅可对患者实行个性化，同时亦可为临床评判病人的预后提供帮助。
[0005] 目前在临床上检测MyD88基因突变的通用方法为传统的DNA直接测序法。DNA直接测序法检测灵敏度只有20～30％，即肿瘤组织样本中必须要含有20～30％的突变阳性细胞才能被检测出来；对于小样本病理组织的检测，直接测序法的检测精度有限，难以满足实际应用的需求。同时，该方法容易造成污染，出现假阳性；操作复杂，耗时长(通常需要2～3天才能出检测结果)。针对此类问题，本发明提供了一种快速、高效、高灵敏度、操作简便的MyD88基因突变检测方法和试剂盒，仅需90分钟即可完成MyD88基因L265P突变的
检测，为临床个体化用药提供准确实验依据。
[0006] 参考文献：
[0007] [1]Ngo VN，Young RM，Schmitz R，et al.Oncogenically active MYD88 mutations in human ly
mphoma.Nature 2011；470(7332):115-119.
[0008] [2]Davis RE，Brown KD，Siebenlist U，et al.Constitutive nuclear factor kB activity is required for survival of activated B cell-like diffuse large B cell lymphoma cells.J Exp Med 2001；194(12):1861-1874.
[0009] [3]Treon SP，Xu L，Guang Y，et al.MYD88 L265P Somatic Mutation in Waldenstr m's Macroglobulinemia.N Engl Med 2012；367(9):826-833.
发明内容
[0010] 为了提高临床检验能力，现提供一种快速有效检测MyD88基因突变的荧光定量PCR方法，该方法可以在90分钟内检测出MyD88基因的L265P突变。
[0011] 本发明的技术方案包含以下步骤：
[0012] 1.根据人类MyD88基因的野生型基因序列和L258P突变型基因序列，设计出多对特异性高效引物和探针，以FAM信号进行荧光标记；L265P突变点位于正向引物的3’端时，TaqMan探针中不包含突变点；当引物对不包含L265P突变点时，L265P突变点位于TaqMan 探针的5’端。
[0013] 2.选择MyD88基因中的保守序列为内控，设计相应的引物和探针，其TaqMan探针以HEX信号进行荧光标记。
[0014] 3.建立荧光定量PCR扩增突变基因序列的反应体系，利用特异性引物通过PCR反应大量扩增目的基因序列。
[0015] 4.可通过两种方式检测荧光信号：
[0016] A：利用荧光标记的特异性探针和扩增产物进行杂交，检测反应体系中荧光信号的强度。
[0017] B：特异性探针与模板上的L265P突变点结合，当上游引物与模板结合并扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5’-3’端外切酶的活性，将探针5’端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而发出荧光。
[0018] 以HEX的信号达到设定阈值(Ct<32)时表明样品DNA中包含MyD88基因，且上样量在允许范围内，说明FAM的信号可信、有效；以FAM信号达到设定阈值时所需的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，当Ct值等于0或≥35时，检测结果判定为阴性，Ct值＜32时，检测结果为阳性。Ct值介于32至35之间为临界值，需重新检测。
[0019] 本发明提供一种用于检测MyD88基因L265P突变的试剂盒，所建立的荧光定量PCR 反应体系为：
[0020]
[0021] 反应体系总体积为25μL，用去离子水补足体积后，漩涡震荡、短暂离心混匀。[0022] 本发明所述荧光定量PCR反应条件是95℃预变性5分钟后进入以下循环：72℃ 20秒，95℃ 15秒，65℃ 20秒，进行10个循环；72℃ 20秒，95℃ 15秒，60℃ 20秒，共35个循环，荧光信号收集温度设定在退火温度。
[0023] 本发明所述特异性引物和特异性探针见表1。P-SEQ-1～P-SEQ-11为正向引物；P-SEQ-12～P-SEQ-17为反向引物；P-SEQ-18～P-SEQ-22为探针。
[0024] 表1：特异性引物和探针
[0025]
[0026] 所述的一种检测MyD88基因L265P突变的荧光定量PCR方法不包括样品DNA提取步骤，但对于从甲醛固定石蜡包埋的样品获得的DNA片段依然具有与从新鲜组织样品中提取的DNA同样的扩增和检测能力。
[0027] 与现有的检测方法相比，本发明具有以下优势：
[0028] (1)建立了荧光定量PCR的方法，可有效检测MyD88基因L265P突变；
[0029] (2)灵敏度高，能检出5～10拷贝的突变；
[0030] (3)特异性强，10～100ng的野生型DNA不会产生非特异性干扰信号；
[0031] (4)选择性强，可在99～99.9％的野生型DNA背景下检测出0.1％～1.0％的突
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