(10)申请公布号 CN 101914614 A
(43)申请公布日 2010.12.15C N 101914614 A
*CN101914614A*
(21)申请号 201010249924.7
(22)申请日 2010.08.10
C12Q 1/48(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
(71)申请人中国人民解放军第二军医大学
地址200433 上海市翔殷路800号
(72)发明人缪朝玉 张偌瑜 管云枫 王培
徐添颖 徐学文
(74)专利代理机构上海智信专利代理有限公司
31002
代理人薛琦 钟华
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种测定烟酰胺磷酸核糖转移
骤：(1)建立Nampt 酶催化底物烟酰胺(NAM)转
热法终止酶反应；(3)加入苯乙酮和强碱充分反
应；(4)再加入甲酸充分反应；和(5)检测激发波
长326～426nm ，发射波长410～520nm 处的荧光
强度。本发明还提供一种Nampt 酶抑制剂或激活
包括在微孔板中将候选化合物和除底物NAM 以外
的Nampt 酶反应体系孵育；然后按前述步骤测定
Nampt 酶活力。本发明方法操作简单，反应条件温
和，可实现高通量操作。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 2 页 说明书 11 页 附图 8 页
1.一种测定烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)建立Nampt酶催化底物烟酰胺(NAM)转化成产物烟酰胺单核苷酸(NMN)的反应；
(2)加热法终止酶反应；
(3)加入苯乙酮和强碱充分反应；
(4)再加入甲酸充分反应；和
(5)检测激发波长326～426nm，发射波长410～520nm处的荧光强度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述反应的反应体系包括：烟酰
、BSA、DTT和DMSO，所述反应的反应胺磷酸核糖转移酶、底物NAM、ATP、PRPP、缓冲液、MgCl
2
条件是室温～37℃，10～60分钟；
步骤(2)中所述的加热法是95℃加热1分钟；
步骤(3)中所述的反应是0～25℃，5～30分钟，苯乙酮和强碱的反应浓度分别为0.222M、2.2％；
步骤(4)中所述的反应是70～90℃反应5～15分钟，甲酸的反应浓度为44％。
3.一种适合如权利要求1或2所述的方法所用的测定烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的试剂盒，其特征在于，包括：烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)和反应底物，所述的反应底物是烟酰胺(NAM)和5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)，还包括苯乙酮、强碱和甲酸。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括反应缓冲液，是包括以下组分溶液
、2mMATP、2mM DTT和2％DMSO。的浓缩液：pH7.5的50mM Tris-HCl、0.02％BSA、12mMMgCl
2
5.一种烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂或激活剂的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
①在微孔板中加入候选化合物和除底物NAM以外的烟酰胺磷酸核糖转移酶反应体系，孵育；
②加入底物NAM启动反应；
③加热法终止酶反应；
④加入苯乙酮和强碱充分反应；
⑤再加入甲酸充分反应；和
⑥检测激发波长326～426nm，发射波长410～520nm处的荧光强度。
6.如权利要求5所述的高通量筛选方法，其特征在于，
步骤①中所述孵育是37℃孵育0～30分钟；
步骤②中，所述反应的反应体系包括：烟酰胺磷酸核糖转移酶、底物NAM、ATP、PRPP、缓冲液、MgCl
、BSA、DTT和DMSO；
2
所述的反应的反应条件是室温～37℃，10～60分钟；
步骤③中所述的加热法是95℃加热1分钟；
步骤④中所述的反应是0～25℃，5～30分钟，苯乙酮和强碱的反应浓度分别为0.222M、2.2％；
步骤⑤中所述的反应70～90℃反应5～15分钟，甲酸的反应浓度为44％；
步骤⑥中使用酶标仪进行检测。
7.如权利要求5所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述的高通量筛选方法包括以下步骤：
(1)酶反应：
酶反应体系为25μl，包括以下各浓度的组分：50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.02％BSA、、2mM ATP、0.4mM PRPP、2mM DTT、2μg/mlNampt、0.2μM NAM、20μM候选化合物12mM MgCl
2
和2％DMSO；
先将0.5μl化合物的DMSO溶液加于96孔板，再加入20μl除底物NAM之外的酶反应混合溶液，37℃预孵育5min后，加入4.5μl底物NAM溶液以启动反应，37℃反应15min后于95℃加热1min终止酶反应；
(2)检测反应：
①在酶反应液中依次加入10μl 20％苯乙酮和2M KOH，混匀后于0℃作用10min，加入45μl 88％甲酸，70℃加热5min，冰上冷却；
②使用酶标仪测定激发波长382nm、发射波长445nm处的荧光强度。
8.一种适合如权利要求5所述的方法所用的烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂或激活剂的高通量筛选系统，其特征在于，包括：
微孔板；
烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)和反应底物，所述的反应底物是烟酰胺(NAM)和5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)；
苯乙酮、强碱和甲酸。
9.如权利要求8所述的高通量筛选系统，其特征在于，所述的筛选系统还包括反应缓
、2mM 冲液，是包括以下组分溶液的浓缩液：50mMTris-HCl(pH7.5)、0.02％BSA、12mM MgCl
2 ATP、2mM DTT和2％DMSO。
10.如权利要求8或9所述的高通量筛选系统，其特征在于，所述的筛选系统还进一步包括阳性对照和阴性对照，所述的阳性对照是已知的烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂或激活剂，所述的阴性对照是溶解候选化合物的溶剂。
测定Nampt酶活性的方法及其试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于化学领域，特别涉及一种测定Nampt酶活性的方法及其试剂盒。本发明还提供一种Nampt酶抑制剂或激活剂的高通量筛选方法及其筛选系统。
背景技术
[0002] 烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt，又名内脏脂肪素visfatin或前B细胞克隆增强因子PBEF)是哺乳动物生命活动中不可或缺的蛋白。Nampt缺陷的纯合子小鼠(Nampt-/-)死于胚胎发育早期。它调控哺乳动物细胞内必需的能量物质NAD辅酶的水平，具有促血管生长、抗细胞凋亡、参与机体炎症应答、促进多种细胞分化成熟、潜在的激活祖细胞等生理功能，对于癌症、脑卒中等疾病防治具有潜在的作用。肿瘤细胞具有很高的NAD消耗和代谢速率，NAD合成途径的限速酶Nampt是癌症防治的靶标，其酶抑制剂FK
866(Hasmann M，et al.，Cancer Research 2003；63：7436-7442.)和CHS-828(HjarnaaPJV，et al.，Cancer Research 1999；59：5751-5757.)目前都已进入癌症的临床前研究。另一方面，NAD具有神经保护作用(Liu D，et al.，Neuromolecular Medicine 2009；11：28-42)，且Nampt可防治脑卒中引起的脑损伤(Zhang W，et al.，J Cereb Blood Flow Metab.2010May 19.Epub ahead of print)，可作为脑卒中防治的新靶标，上调Nampt酶活性将有利于应对脑卒中发生发展的多种病理因素，因此Nampt激活剂可能成为有效防治脑卒中的新药。
[0003] 癌症、脑卒中是威胁人类健康和生命的两大重要疾病，也是全球生命科学和医学领域关注的焦点，因此发现调节Nampt酶活性的小分子将对这些重大疾病的防治具有重要的意义。高通量筛选是新药研发的重要手段之一，分子水平的筛选体系有助于提高筛选速度、增加筛选通量、降低筛选成本。然而目前还没有以Nampt为靶标的筛选体系报道；Nampt 酶活性抑制剂仅报道了3个，FK866、CHS-828以及基于FK866结构改造的分子IS001(Kang GB，et al.，Molecules and Cells 2009；27：667-671.)；而Nampt酶激活剂至今尚无一例报道。
[0004] 目前已报道的Nampt酶活性测定方法主要有三种：使用放射性底物以得到放射性标记的产物；用HPLC分离反应产物；将产物NMN经Nmnat酶转化为NAD，再被乙醇脱氢酶转化为荧光产物NADH。这些方法或者操作不安全，或者步骤繁琐，或者成本较高，均不适合通量化操作。
发明内容
[0005] 因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的测定Nampt酶活性的方法不能实现高通量操作的缺陷，提供一种测定Nampt酶活性的方法及其试剂盒，该方法操作简单，可实现高通量操作。本发明还提供一种Nampt酶抑制剂或激活剂的高通量筛选方法及其筛选系统。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种测定烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的方法，包括以下步骤：
[0007] (1)建立Nampt酶催化底物烟酰胺(NAM)转化成产物烟酰胺单核苷酸(NMN)的反应；
[0008] (2)加热法终止酶反应；
[0009] (3)加入苯乙酮和强碱充分反应；
[0010] (4)再加入甲酸充分反应；和
[0011] (5)检测激发波长326～426nm，发射波长410～520nm处的荧光强度。[0012] 其中，步骤(1)中，所述的反应的反应体系可以是常规的适用于Nampt酶催化NAM转化成NMN的反应体系，较佳的包括：烟酰胺磷酸核糖转移酶、底物NAM、ATP、PRPP、、BSA、DTT和DMSO。其中，Nampt酶反应浓度较佳的是1～8μg/ml，更佳缓冲液、MgCl
2
的是2μg/ml。底物NAM反应浓度较佳的是0.2～2μM，更佳的是0.2μM。DMSO浓度较佳的是1～8％，更佳的是2％。所述的反应的反应体系更佳的包括以下各浓度的组分：
、2mM ATP、0.4mM PRPP、2mMDTT、2μg/ml 50mMTris-HCl(pH7.5)、0.02％BSA、12mM MgCl
2
Nampt、0.2μM NAM、和2％DMSO。所述的反应的反应条件是常规的Nampt酶的反应条件。Nampt酶的最佳反应温度是37℃。酶反应时间较佳的是10～60分钟，更佳的是10～30分钟，最佳的是15分钟。
[0013] 步骤(2)中，所述的加热法是常规的终止酶反应的方法，加热使酶变性而失去活性，从而酶反应终止。较佳的是95℃加热1分钟。
[0014] 步骤(3)中，所述的反应的反应温度较佳的是0～25℃，更佳的是0℃，反应时间较佳的是5～30分钟，更佳的是5～10分钟。苯乙酮和强碱的反应浓度较佳的分别为0.222M、2.2％。本发明中，所述的强碱较佳的是NaOH或KOH，更佳的是KOH。
[0015] 步骤(4)中，所述的反应较佳的为70～90℃反应5～15分钟，更佳的是70℃反应5分钟。
[0016] 步骤(5)中，所述荧光强度的检测方法是现有技术。较佳的使用酶标仪进行检测。荧光检测的波长
范围：激发波长326～426nm，发射波长410～520nm，最佳激发波长为382nm，最佳发射波长为445nm。
[0017] 本发明也提供一种测定烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的试剂盒，包括：烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)和反应底物，所述的反应底物是NAM(烟酰胺)和PRPP(5-磷酸核糖-1-焦磷酸)，还包括苯乙酮、强碱和甲酸。
[0018] 本发明中，所述的试剂盒较佳的还进一步包括反应缓冲液。所述的反应缓冲液是常规的用于进行Nampt酶催化底物烟酰胺(NAM)和PRPP生成产物烟酰胺单核苷酸(NMN)的缓冲液。较佳的是包括以下组分溶液的浓缩液：50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.02％BSA、12mM MgCl
、2mM ATP、2mM DTT和2％DMSO。上述浓度的溶液中各组分的是较佳的工作浓度，而所2
述浓缩液中各组分的浓度是其倍数，该浓缩倍数可以是常规，较佳的是10倍。DMSO浓度较佳的是1～8％，更佳的是2％。
[0019] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂或激活剂的高通量筛选方法，包括以下步骤：
[0020] ①在微孔板中加入候选化合物和除底物NAM以外的烟酰胺磷酸核糖转移酶反应体系，孵育；
[0021] ②加入底物NAM启动反应；
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