(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510505581.9
(22)申请日 2015.08.17
C12Q 1/68(2006.01)
地址510665 广东省广州市经济技术开发区
科学城荔枝山路6号1号楼510室
(72)发明人陈华云 刘淑园 陈嘉昌 肖湘文
丁渭 黄爽 曾烨 邓金萍
(74)专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有
限公司 44205
代理人胡辉 许飞
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种恒温扩增技术，其使
Tris-H 2SO 4、硫酸铵、乙酸镁、二硫苏糖醇、甜菜碱、
Tween20、PEG、BSA、dNTPs 以及聚合酶、单链结合
蛋白、重组酶，各适量。本发明的恒温扩增体系，
不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现
有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低
廉，使用更为方便。本发明的恒温扩增体系可以
对DNA 和RNA 序列实现扩增，适用于复杂模板的 扩增，扩增速度快且稳定，可以在15min 以内完成
扩增反应，扩增的灵敏度和准确性高，不易出现错
配，扩增效果好。本发明的恒温扩增体系可以用于
实时定量，应用范围更广。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书9页序列表1页 附图3页CN 105087795 A 2015.11.25
C N 105087795
A
1.一种恒温扩增反应试剂，溶剂为水，其组成如下：
Tris-H
2SO
4
0mM--500mM
硫酸铵 0mM--250mM
乙酸镁3mM--50mM
二硫苏糖醇 0mM--10mM
甜菜碱 0M-5M
Tween20 0%-10%
PEG 1%--20%
BSA 0mg/mL--10mg/mL
dNTPs 180uM--1000uM
聚合酶、单链结合蛋白、重组酶，各适量；
重组酶为不依赖于能量分子ATP系统的重组酶。
2.根据权利要求1所述的恒温扩增反应试剂，其特征在于：其组成如下：
Tris-H
2SO
4
10mM--150mM
硫酸铵 0mM--150mM
乙酸镁5mM--20mM
二硫苏糖醇 0mM--10mM
甜菜碱 0M-2M
Tween20 0%-1%
PEG 1%--20%
BSA 0mg/mL--1mg/mL dNTPs 200uM--500uM 聚合酶、单链结合蛋白、重组酶，各适量。
3.根据权利要求1所述的恒温扩增反应试剂，其特征在于：Tris-H
2SO
4
的pH为7～9。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的恒温扩增反应试剂，其特征在于：恒温扩增反应试剂中还添加有荧光染料。
5.根据权利要求4所述的恒温扩增反应试剂，其特征在于：荧光染料为SYBR green Ι，SYTO-9，SYTO-12，SYTO-60，SYTO-62，SYTO-16，SYTO-82或POPO-3，TOTO-3，TO-PRO-3中的一种。
6. 根据权利要求1～3任意一项所述的恒温扩增反应试剂，其特征在于：重组酶选自
7.根据权利要求1～3任意一项所述的恒温扩增反应试剂，其特征在于：恒温扩增反应试剂中添加有逆转录酶，用于检测RNA。
8.一种核酸恒温扩增方法，包括将引物、模板与恒温扩增反应试剂混合，恒温扩增至预期量后，将恒温扩增反应体系的酶灭活，完成恒温扩增，其中，恒温扩增反应试剂如权利要求1～7任意一项所述。
9.根据权利要求8所述的种核酸恒温扩增方法，其特征在于：恒温扩增的温度为35～42℃。
一种恒温扩增技术
技术领域
[0001] 本发明涉及一种核酸恒温扩增技术，特别涉及一种不依赖于高能能量分子的恒温扩增技术。
背景技术
[0002] 1983年，Mullis等发明了聚合酶链式反应（PCR)技术，30多年间，PCR技术得到长足发展，由于其在灵敏度和特异性方面的优势，PCR技术被迅速运用到科学研究和临床研究的各个方面。这种类似于DNA的天然复制过程的PCR技术，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。主要包括三个基本反应步骤：(1)模板DNA的变性：通过加热一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，成为单链；（2）模板DNA与引物的退火（复性）：温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；（3）引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条
新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。这一技术的开发极大地促进了生物研究的进展。
[0003] PCR在技术应用上也有几点限制：第一，PCR技术需要昂贵的实验室仪器，同时仪器要具备精细的温度控制程序和加热模板，从而实现很高的温度下的DNA模板链的变性，较低的温度下引物探针退火延伸模板，这样重复温度变化几十个循环之后实现模板量的放大。由于每一个循环时间都较短，仪器必须能快速准确升降温度，这就需要银制或金制的加热模块，加大仪器研制的成本。第二，PCR扩增体系中有用的聚合酶必须具有耐受高温的能力，否则则必须在每一个循环中重新加入新酶，以实现下一循环的扩增，这样极容易造成污染也加大了成本。第三，在PCR循环中，每一个循环引物退火的时间都很短（几秒到十几秒）这就要求引物必须快速到模板上同源匹配的区段，以实现延伸。这就要求PCR体系必须有过量的PCR引物。过量的引物会与模板错配，错误引发扩增，引物二聚体等等，进而抑制PCR扩增，特别是在模板量低的情况，会使这种情况加剧。
[0004] 与传统的PCR技术相比，恒温扩增技术主要利用重组酶的活性，不进行核酸解链和退火即可在恒温条件下（如37℃）进行核酸的扩增，因此不需要昂贵的仪器，也避免了高温对酶的损耗。同时恒温扩增技术在体系中不需要加入过量的引物，降低了引物与模板错配或生成引物二聚体的可能性。恒温扩增技术日益受到重视。
[0005] 常见的等温扩增技术有以下几种：滚环恒温扩增（RCA)，环介导恒温扩增(LAMP)，依赖解旋酶恒温扩增（HDA)等。现有的恒温扩增技术，其反应体系比较复杂，同时绝大部分恒温扩增体系要么依赖于ATP，要么依赖于肌酸激酶和磷酸肌酸，或其他高能能量分子，所需的试剂种类繁多，扩增速度受限于能量的供给，这导致恒温扩增技术成本比较高，限制了其应用。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种不依赖于高能能量分子的核酸恒温扩增反应试剂及方法。
[0007] 本发明所采取的技术方案是：
一种恒温扩增反应试剂，溶剂为水，其组成如下：
Tris-H
2SO
4
0mM--500mM
硫酸铵 0mM--250mM
乙酸镁3mM--50mM
二硫苏糖醇 0mM--10mM
甜菜碱 0M-5M
Tween20 0%-10%
PEG 1%--20%
BSA 0mg/mL--10mg/mL
dNTPs 180uM--1000uM
聚合酶、单链结合蛋白、重组酶，各适量；
重组酶为不依赖于能量分子ATP系统的重组酶。[0008] 优选的，其组成如下：
Tris-H
2SO
4
10mM--150mM
硫酸铵 0mM--150mM
乙酸镁5mM--20mM
二硫苏糖醇 0mM--10mM
甜菜碱 0M-2M
Tween20 0%-1%
PEG 1%--20%
BSA 0mg/mL--1mg/mL
dNTPs 200uM--500uM
聚合酶、单链结合蛋白、重组酶，各适量。
[0009] 作为上述反应试剂的进一步改进，所使用的Tris-H2SO4的pH为7～9。
[0010] 作为上述反应试剂的进一步改进，当该反应体系用于荧光定量分析时，恒温扩增反应试剂中还添加有荧光染料。荧光染料为SYBR green Ι，SYTO-9，SYTO-12，SYTO-60，SYTO-62，SYTO-16，SYTO-82或POPO-3，TOTO-3，TO-PRO-3中的一种。此外，在该反应体系中使用荧光探针时，也可以实现荧光定量分析。
[0011] 作为上述反应试剂的进一步改进，重组酶选自E.coli RecT蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母SepΙ/STPβ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPα蛋白；粟酒裂殖酵母p140/ Exo�蛋白以及RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。
[0012] 作为上述反应试剂的进一步改进，恒温扩增反应试剂中添加有逆转录酶，用于检测RNA。
[0013] 作为上述反应试剂的进一步改进，恒温扩增反应试剂扩增后可以用凝胶电泳、试纸条检测等方法对反应产物进行检测。
[0014] 一种核酸恒温扩增方法，包括将引物、模板与恒温扩增反应试剂混合，恒温扩增至预期量后，将恒温扩增反应体系的酶灭活，完成恒温扩增
作为上述方法的进一步改进，恒温扩增的温度为35～42℃。
[0015] 本发明的有益效果是：
本发明的恒温扩增体系，不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。
[0016] 本发明的恒温扩增体系可以对DNA和RNA序列实现扩增，适用于复杂模板的扩增，扩增速度快且稳定，可以在15 min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确性高，不易出现错配，扩增效果好。
[0017] 本发明的恒温扩增体系可以用于实时定量，应用范围更广。
附图说明
[0018] 图1是不同实施例的恒温扩增结果图；
图2是不同实施例的荧光染料恒温扩增结果图；
图3是不同实施例的荧光探针恒温扩增结果图。
具体实施方式
[0019] 一种恒温扩增反应试剂，溶剂为水，其组成如下：
Tris-H
2SO
4
0mM--500mM
硫酸铵 0mM--250mM
乙酸镁 3mM--50mM
二硫苏糖醇 0mM--10mM
甜菜碱 0M-5M
Tween20 0%-10%
PEG 1%--20%
BSA 0mg/mL--10mg/mL dNTPs 180uM--1000uM
聚合酶、单链结合蛋白、重组酶，各适量；
重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。[0020] 优选的，其组成如下：
Tris-H
2SO
4
10mM--150mM
硫酸铵 0mM--150mM
乙酸镁 5mM--20mM
二硫苏糖醇 0mM--10mM
甜菜碱 0M-2M
Tween20 0%-1%
PEG 1%--20%
BSA 0mg/mL--1mg/mL dNTPs 200uM--500uM
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