(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911062021.5
(22)申请日 2019.11.01
(71)申请人 西北农林科技大学
地址 712100 陕西省咸阳市杨凌示范区邰
城路3号
(72)发明人 管清美 牛春东 曹富国 施焕然
陈鹏翔
(74)专利代理机构 西安长和专利代理有限公司
61227
代理人 何畏
(51)Int.Cl.
C12N 15/66(2006.01)
C12Q 1/6876(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
C12N 15/82(2006.01)
A01H 5/12(2018.01)A01H 6/82(2018.01) (54)发明名称
法和应用
(57)摘要
领域，公开了一种Gateway克隆系统的植物表达
载体及构建方法和应用，所述Gateway克隆系统
的植物表达载体分别为P K G M Y C ，P K N Y F P 和
PKCYFP；PKGMYC的序列为SEQ ID NO：1；PKNYFP的
序列为SEQ ID NO：2；PKCYFP的序列为SEQ ID
NO：3。本发明以pK7GWIWG2D(II),0或pK2GW7为骨
架，这两个载体分别使用SacI/KpnI和SacI/PmeI
核酸内切酶进行双酶切；通过同源重组技术将其
他Gateway系列载体构建入这两个载体，形成以
卡那霉素为筛选标记的植物表达载体；同时，
pK7GWIWG2D(II),0为骨架的改造载体还具有非
融合的GFP荧光蛋白筛选标记。权利要求书2页 说明书7页序列表14页 附图10页CN 110904137 A 2020.03.24
C N 110904137
A
1.一种Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法以pK7GWIWG2D(II)或pK2GW7为骨架，两个载体分别使用SacI/KpnI和SacI/PmeI核酸内切酶进行双酶切；通过同源重组技术将其他Gateway系列载体构建入两个载体。
2.如权利要求1所述的Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法包括：
Gateway克隆系统的植物表达载体PKGMYC的构建方法将pEarleyGate203的35s-myc-attR1-ccdb-attR2-OCS terminal片段置换pK7GWIWG2D(II)部分片段形成PKGMYC；
Ga te wa y克隆系统的植物表达载体pK C YF P和pK N YF P载体的构建方法包括：将pEarleyGate101的35s-attR1-ccdb-attR2-YFP-HA-OCS terminal或pEarleyGate104的35s-YFP-attR1-ccdb-attR2-OCS terminal片段置换pK2GW7的部分片段，分别形成PKCYFP 和PKNYFP。
3.如权利要求2所述Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述Gateway克隆系统的植物表达载体PKGMYC的构建方法具体包括：
(1)设计引物；SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；使用NEB Phusion高保真聚合酶，以pEarleyGate203为模板，扩增得到片段F1；PCR反应程序为98℃30s；98℃10s，62℃30s，72℃4min，32个循环；72℃10min；
(2)使用SacI-HF和KpnI-HF核酸内切酶在37℃培养箱酶切pK7GWIWG2D(II)载体30min；
(3)PCR及酶切完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离片段，并使用Thermo Scientific的Gene JET Gel Extraction Kit并按照试剂盒说明书回收DNA片段；
(4)使用vazyme公司的ClonExpress II One Step Cloning Kit并按照说明书进行连接；37℃反应30min；
(5)连接完成后，将连接产物转化DB3.1热激感受态，同时转化TOP10热激感受态，检测ccdB致死情况；转化完成后涂布于Spec抗性的LB固体培养基，37℃倒置培养12-16h；第二天挑取单克隆，并用Spec抗性的LB液体培养基摇菌12h，使用天根质粒小提中量试剂盒提取质粒，并测序。
4.如权利要求2所述Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述Gateway克隆系统的植物表达载体pKCYFP和pKNYFP载体的构建方法具体包括：设计引物；SEQ ID NO：6和SEQ ID N
O：7；使用NEB Phusion高保真聚合酶，以pEarleyGate101或pEarleyGate104为模板，分别扩增得到片段F2和F3；
使用NEB公司的SacI-HF和PmeI核酸内切酶在37℃培养箱酶切pK2GW7载体30min；
PCR及酶切完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离片段，并使用Thermo Scientific的Gene JET Gel ExtractionKit回收DNA片段；
将pEarleyGate101为模板的扩增片段与pK2GW7酶切片段连接，得到PKCYFP，将pEarleyGate104为模板的扩增片段与pK2GW7酶切片段连接，得到PKNYFP；质粒提取后，测序。
5.一种如权利要求1所述Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法的测序引物，其特征在于，所述Gateway克隆系统的植物表达载体测序引物的序列为：
载体PKGMYC测序引物为使用SP1的序列为SEQ ID NO：8；SP2的序列为SEQ ID NO：9；SP3
的序列为SEQ ID NO：10；SP4的序列为SEQ ID NO：11；SP7的序列为SEQ ID NO：14；SP8的序列为SEQ ID NO：15；
PKCYFP载体的测序引物为SP2的序列为SEQ ID NO：9；SP3的序列为SEQ ID NO：10；SP4的序列
为SEQ ID NO：11；SP5的序列为SEQ ID NO：12；SP6的序列为SEQ ID NO：13；SP7的序列为SEQ ID NO：14；SP9的序列为SEQ ID NO：16；
PKNYFP载体的测序引物为SP2的序列为SEQ ID NO：9；SP3的序列为SEQ ID NO：10；SP4的序列为SEQ ID NO：11；SP5的序列为SEQ ID NO：12；SP6的序列为SEQ ID NO：13；SP7的序列为SEQ ID NO：14；SP8的序列为SEQ ID NO：15；SP9的序列为SEQ ID NO：16。
6.一种由权利要求1～4任意一项所述Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法构建的Gateway克隆系统的植物表达载体，其特征在于，所述Gateway克隆系统的植物表达载体分别为PKGMYC，PKNYFP和PKCYFP；
PKGMYC的序列为SEQ ID NO：1；PKNYFP的序列为SEQ ID NO：2；PKCYFP的序列为SEQ ID NO：3。
7.一种如权利要求6所述Gateway克隆系统的植物表达载体在转基因技术中的应用。
Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术和植物基因工程技术领域，尤其涉及一种Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用。
背景技术
[0002]目前，最接近的现有技术：转基因技术自20世纪80年代初开始，逐步发展为一种在生物领域应用最广泛的基因研究方法，可通过农杆菌介导转化、花粉管通道法、基因法等技术将人工分离和修饰过的优质基因导入到植物基因组中，达到改造植物的目的。转基因技术可快速实现目标性状的改良，具有可用基因资源广、改良效率高等优点，为农作物产量及品质的提升、抗逆性的增强提供了新的路径。
[0003]基因载体作为基因导入细胞的工具，对转基因的成败起到决定性的作用。双元表达载体系统在植物基因工程中应用最为广泛，是指农杆菌中用于把T-DNA区域转入受体细胞的双质粒系统，其中一个质粒具有改造过的T-DNA区域，用于携带外源基因；另一个质粒带有毒性基因，用于T-DNA的转移。构建植物过表达载体可通过酶切连接的方式，如pCambia 系列，pRI系列载体等，也可以通过Gateway技术构建载体，如pEarlygate等系列载体。选择合适的过表达载体，对于转基因的发展具有重要作用。选择过表达载体时通常需要考虑以下几个问题：1、载体的筛选标记，以便于转基因株系的筛选鉴定；2、启动外源基因的强弱，通常选用35s启动子、NOS(nopaline synthase)启动子、基因本身启动子等；3、是否有标签蛋白与过表达基因融合，便于过表达后蛋白水平的鉴定及后续实验，通常选用的标签蛋白有My
c、Flag、HA、GFP(Green Fluorescent Protein)、YFP(Yellow Fluorescent Protein)等。在转基因过程中，抗生素抗性基因是主要的筛选标记，通常在表达载体中具有表达某种抗生素的抗性基因，如卡那霉素(kana)抗性基因、Basta抗性基因、潮霉素抗性基因等。但是不同的植物对于不同的抗生素具有一定的敏感性，如苹果转基因通常采用卡那霉素作为筛选标记。另外，也可以通过一些荧光蛋白等作为筛选标记，如GFP。
[0004]Gateway技术利用位点特异重组，在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶，达到快速简便的构建各种表达载体。在一般使用的大肠杆菌中，如TOP10、DH5α等，gateway系列载体因具有ccdB毒性蛋白而将其杀死，因此，该系列载体只能在特定的大肠杆菌中复制，如DB3.1。Gateway技术可通过BP或LR反应将ccdB基因置换，保证构建成功的载体在TOP10、DH5α等大肠杆菌中正常复制，ccdB基因能够产生毒蛋白而无法使菌存活，而原始载体则因为ccdB基因的表达而使这些大肠杆菌致死。
[0005]综上所述，现有技术存在的问题是：pEarlygate系列载体由于其过表达能力强、利用Gateway技术快速简便的构建载体、具有标签蛋白等，广泛应用于拟南芥的遗传转化中。但是由于其筛选标记是Basta，无法应用于苹果的遗传转化。
发明内容
[0006]针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种Gateway克隆系统的植物表达载体
及构建方法和应用。
[0007]本发明是这样实现的，一种Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法，所述Gateway克隆系统的植物表达载体PKGMYC的构建方法将pEarleyGate203的35s-myc-attR1-ccdb-attR2-OCS terminal片段置换pK7GWIWG2D(II)部分片段形成PKGMYC；
[0008]所述Gateway克隆系统的植物表达载体pKCYFP和pKNYFP载体的构建方法包括：将pEarleyGate101的35s-attR1-ccdb-attR2-YFP-HA-OCS terminal或pEarleyGate104的35s-YFP-attR1-ccdb-attR2-OCS terminal片段置换pK2GW7的部分片段，分别形成PKCYFP 和PKNYFP。
[0009]进一步，所述Gateway克隆系统的植物表达载体PKGMYC的构建方法具体包括：[0010](1)设计引物；SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；使用NEB Phusion高保真聚合酶，以pEarleyGate203为模板，扩增得到片段F1；PCR反应程序为98℃ 30s；98℃ 10s，62℃ 30s，72℃ 4min，32个循环；72℃ 10min；
[0011](2)使用SacI-HF和KpnI-HF核酸内切酶在37℃培养箱酶切pK7GWIWG2D(II)载体30min；
[0012](3)PCR及酶切完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离片段，并使用Thermo Scientific 的Gene JET Gel
Extraction Kit并按照试剂盒说明书回收DNA片段；
[0013](4)使用vazyme公司的ClonExpress II One Step Cloning Kit并按照说明书进行连接；37℃反应30min；
[0014](5)连接完成后，将连接产物转化DB3.1热激感受态，同时转化TOP10热激感受态，检测ccdB致死情况；转化完成后涂布于Spec抗性的LB固体培养基，37℃倒置培养12-16h；第二天挑取单克隆，并用Spec抗性的LB液体培养基摇菌12h，使用天根质粒小提中量试剂盒提取质粒，并测序。
[0015]进一步，所述Gateway克隆系统的植物表达载体pKCYFP和pKNYFP载体的构建方法具体包括：
[0016]设计引物；SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；使用NEB Phusion高保真聚合酶，以pEarleyGate101或pEarleyGate104为模板，分别扩增得到片段F2和F3；
[0017]使用NEB公司的SacI-HF和PmeI核酸内切酶在37℃培养箱酶切pK2GW7载体30min；[0018]PCR及酶切完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离片段，并使用Thermo Scientific的Gene JET Gel Extraction Kit回收DNA片段；
[0019]将pEarleyGate101为模板的扩增片段与pK2GW7酶切片段连接，得到PKCYFP，将pEarleyGate104为模板的扩增片段与pK2GW7酶切片段连接，得到PKNYFP；质粒提取后，测序。
[0020]本发明的另一目的在于提供一种所述Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法的测序引物，所述Gateway克隆系统的植物表达载体测序引物的序列为：
[0021]载体PKGMYC测序引物为使用SP1的序列为SEQ ID NO：8；SP2的序列为SEQ ID NO：9；SP3的序列为SEQ ID NO：10；SP4的序列为SEQ ID NO：11；SP7的序列为SEQ ID NO：14；SP8的序列为SEQ ID NO：15；
[0022]PKCYFP载体的测序引物为SP2的序列为SEQ ID NO：9；SP3的序列为SEQ ID NO：10；SP4的序列为SEQ ID NO：11；SP5的序列为SEQ ID NO：12；SP6的序列为SEQ ID NO：13；SP7的
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