(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011598782.5
(22)申请日 2020.12.30
(71)申请人 北京科牧丰生物制药有限公司
地址 102629 北京市大兴区中关村科技园
区大兴生物医药产业基地祥瑞大街25
号
申请人 兆丰华生物科技（南京）有限公司
兆丰华生物科技（南京）有限公司北
京生物医药科技中心
兆丰华生物科技（福州）有限公司
(72)发明人 于萍萍 吕帅阳 刘昊 徐慧敏
卢晓楠 韩昱鹏 刘奇 张渊魁
王敏
(74)专利代理机构 北京金蓄专利代理有限公司
11544
代理人 赵敏
(51)Int.Cl.C07K 16/12(2006.01)C07K 16/06(2006.01) (54)发明名称
法
(57)摘要
本发明属于生物血清制备技术领域，
具体涉及一种抗猪肺炎支原体高免血清，并进一步公开
其制备方法。本发明所述抗猪肺炎支原体高免血
清，其以保藏编号为CGMCC No.4545的猪肺炎支
原体DJ ‑166菌株制备的灭活疫苗为免疫原，并从
免疫兔中分离血清制得，其物理性状良好，加稀
释液后可迅速溶解，无细菌、霉菌和支原体生长，
无外源病毒污染；本发明所述高免血清来源于兔
体，作为一种标准血清特异性抗体在特异性检验
中，与猪肺炎支原体呈阳性反应，与猪鼻支原体
抗原和猪絮状支原体抗原呈阴性反应；且‑40℃
以下保存，有效期为36个月，具有特异性强、稳定
性好的优势，可用于制备猪肺炎支原体试剂和标
准物质。权利要求书1页 说明书7页 附图1页CN 112300276 A 2021.02.02
C N 112300276
A
1.一种抗猪肺炎支原体高免血清，其特征在于，其以保藏编号为CGMCC No.4545的猪肺炎支原体DJ -166菌株制备的灭活疫苗为免疫原，并从免疫兔中分离血清制得。
2.根据权利要求1所述的抗猪肺炎支原体高免血清，其特征在于，所述猪肺炎支原体DJ -166株灭活疫苗为将所述猪肺炎支原体DJ -166株灭活与油佐剂乳化制备而成。
3.一种制备权利要求1或2所述高免血清的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）免疫：以保藏编号为CGMCC No.4545的所述猪肺炎支原体DJ -166株的灭活疫苗为免疫原进行健康大白兔的免疫； （2）采血：于免疫完成后14-21天，检测抗体效价，当所述琼扩抗体效价≥1：16时即为合格，对大白兔进行采血；
（3）血清分离：将采集的兔血进行培养，经固液分离收集血清，备用；
（4）血清纯化：将收集的血清样品离心并收集上清液，采用protein A亲和柱进行纯化，收集目的峰位置的纯化样品，即得。
4.根据权利要求3所述高免血清的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述免疫步骤具体包括：第一次免疫为肌肉注射，免疫剂量3-5ml；在第一次免疫后14日进行第二次免疫，免疫剂量3-5ml，并分两点注射；在第二次免疫后14日进行第三次免疫，免疫剂量3-5ml，并分两点注射。
5.根据权利要求4所述高免血清的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述兔血培养的步骤包括先后于37℃放置1-2h的步骤，以及于4℃放置4h -24h的步骤。
6.根据权利要求5所述高免血清的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述protein A亲和柱纯化步骤中，以10-20mmol/L PB溶液平衡柱子，并以100-300mmol/L柠檬酸钠溶液进行洗脱。
7.根据权利要求6所述高免血清的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述步骤
（4）中，还包括在所述纯化样品中加入pH7.5-8.5的Tris -NaCl调节液的步骤。
8.根据权利要求7所述高免血清的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述protein A亲和柱纯化步骤具体包括：将血清用冰冷的10-20mmol/L PB溶液稀释5倍，备用；用冰冷的10-20mmol/L PB溶液平衡2.5ml的protein A亲和柱10-20个柱体；随后将20ml稀释的样品上柱结合；上样完毕用冰冷的10-20
mmol/L PB溶液平衡2.5ml的protein A亲和柱10-20个柱体；再用100-300mmol/L柠檬酸钠溶液洗脱，每个组分收集1ml，收集完毕，立即加入PH8.0的Tris -NaCl调节混匀即可。
9.根据权利要求3-8任一项所述高免血清的制备方法，其特征在于，所述方法还包括将所述高免血清进行冻干的步骤，即将收集血清样品除菌，并加入冻干保护剂进行冻干处理，得到血清冻干产品。
10.根据权利要求9所述高免血清的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括明胶、蔗糖、海藻糖、甘露糖或小牛血清白蛋白中的一种或几种的混合物；
所述冻干保护剂的加入量占所述血清冻干产品总量的10-40wt%。
权 利 要 求 书1/1页CN 112300276 A
一种抗猪肺炎支原体高免血清及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物血清制备技术领域，具体涉及一种抗猪肺炎支原体高免血清，并进一步公开其制备方法。
背景技术
[0002]猪支原体肺炎（Mycoplasma Pneumoniae of swine，MPS）俗称猪喘气病，又称猪地方流行性肺炎，是一种由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhy）引起的一种高发病率、低死亡率的猪慢性接触性呼吸道传染病。MPS广泛分布于世界各地，大多数养猪国家均有报道此病发生，猪中Mhy感染率为30%-90%，主要表现为咳嗽和气喘，肺部呈现暗红至灰的“肉样”或“胰样”实变。猪支原体肺炎一般患猪死亡率不高，其主要危害是引起猪的生长受阻和饲料转化率大幅下降，长期生长发育不良，严重影响养猪业的经济效益。[0003]目前，免疫接种猪肺炎支原体疫苗是防控MPS的重要措施之一，也是控制猪支原体肺炎最有效的方法，可有效减少肺部损失、提高饲料转化率、缩短出栏时间。通常在疫苗免疫后，效力实验的评价方法中，猪免疫攻毒实验是最有效的手段。但是，通常实验猪筛选较为困难，且人工费、饲养费成本高，实验时间也长达两个月。因此，寻一种纯度高、特异性强、稳定性好的检测抗体，以体外相对效力检测方法代替动物攻毒实验，以实现便捷经济的体外效力检测，对于猪肺炎支原体疫苗的接种具有积极的意义。
发明内容
[0004]为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种纯度高、特异性强、稳定性好的猪肺炎支原体高免血清检测抗体，可用于猪肺炎支原体疫苗的体外评价；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述猪肺炎支原体高免血清的制备方法。[0005]为解决上述
技术问题，本发明所述的一种抗猪肺炎支原体高免血清，其以保藏编号为CGMCC No.4545的猪肺炎支原体DJ-166菌株制备的灭活疫苗为免疫原，并从免疫兔中分离血清制得。
[0006]具体的，所述猪肺炎支原体DJ-166株灭活疫苗为将所述猪肺炎支原体DJ-166株灭活与油佐剂乳化制备而成。
[0007]本发明还公开了一种制备所述高免血清的方法，包括如下步骤：（1）免疫：以保藏编号为CGMCC No.4545的所述猪肺炎支原体DJ-166株的灭活疫苗为免疫原进行健康大白兔的免疫；
（2）采血：于免疫完成后14-21天，检测抗体效价，当所述琼扩抗体效价≥1：16时即为合格，对大白兔进行采血；
（3）血清分离：将采集的兔血进行培养，经固液分离收集血清，备用；
（4）血清纯化：将收集的血清样品离心并收集上清液，采用protein A亲和柱进行纯化，收集目的峰位置的纯化样品，备用；
（5）冻干：将收集血清样品除菌，并加入冻干保护剂进行冻干处理，即得。
[0008]具体的，所述步骤（1）中，所述免疫步骤具体包括：第一次免疫为肌肉注射，免疫剂量3-5ml；
在第一次免疫后14日进行第二次免疫，免疫剂量3-5ml，并分两点注射；在第二次免疫后14日进行第三次免疫，免疫剂量3-5ml，并分两点注射。
[0009]具体的，所述步骤（3）中，37℃放置1-2h的步骤，以及于4℃放置4h-24h的步骤。[0010]具体的，所述步骤（4）中，所述protein A亲和柱纯化步骤中，以10-20mmol/L PB溶液平衡柱子，并以100-300mmol/L柠檬酸钠溶液进行洗脱。
[0011]具体的，所述步骤（4）中，还包括在所述纯化样品中加入pH7.5-8.5的Tris-NaCl调节液的步骤。
[0012]具体的，所述步骤（4）中，所述protein A亲和柱纯化步骤具体包括：将血清用冰冷的10-20mmol/L PB溶液稀释5倍，备用；再用冰冷的10-20mmol/L PB溶液平衡2.5ml的protein A亲和柱10-20个柱体；随后将20ml稀释的样品上柱结合；上样完毕用冰冷的10-20mmol/L PB溶液平衡2.5ml的protein A亲和柱10-20个柱体；再用100-300mmol/L柠檬酸钠溶液洗脱，每个组分收集1ml，收集完毕，立即加入PH8.0的Tris-NaCl调节混匀即可。[0013]优选的，所述方法还包括将所述高免血清进行冻干的步骤，即将收集血清样品除菌，并加入冻干保护剂进行冻干处理，得到血清冻干产品。
[0014]具体的，所述冻干保护剂包括明胶、蔗糖、海藻糖、甘露糖或小牛血清白蛋白中的一种或几种的混合物；
所述冻干保护剂的加入量占所述血清冻干产品总量的10-40wt%。
[0015]本发明所述抗猪肺炎支原体高免血清，其以保藏编号为CGMCC No.4545的猪肺炎支原体DJ-166菌株制备的灭活疫苗为免疫原，并从免疫兔中分离血清制得，其物理性状为淡黄海绵状疏松团块且形状良好，加稀释液后可迅速溶解，无细菌、霉菌和支原体生长，无外源病毒污染，最重要的是，本发明所述高免血清来源于兔体，作为一种标准血清特异性抗体在特异性检验中，与猪肺炎支原体呈阳性反应，与猪鼻支原体抗原和猪絮状支原体抗原呈阴性反应；且-40℃以下保存，有效期为36个月，具有特异性强、稳定性好的优势，可用于制备猪肺炎支原体试剂和标准物质。
[0016]本发明所述抗猪肺炎支原体高免血清的制备方法，通过将猪肺炎支原体DJ-166株制备成灭活疫苗，并对健康新西兰大白兔进行免疫，当琼扩抗体效价≥1:16时，采血并分离血清，采用protein A亲和柱层析纯化血清进行冻干分装。本发明所述方法采用protein A 亲和层析柱法纯化的血清比传统的离心法，对血清具有浓缩作用，制备的抗体纯度和浓度均有效提高，抗体效价是传统方法的两倍；而且有效的去除了非特异性成分，与猪源相关血清和抗原交叉反应低，特异性更强；本发明所述高免血清采用兔子制备的高免血清，并加入冻干保护剂组份，保存期比传统方法延长16个月，且稳定性更好。
附图说明
[0017]为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为纯化步骤前后血清样品的SDS-PAGE电泳图；其中，泳道1为纯化后，泳道2为纯化前；
图2为纯化后的血清与2771株和DJ-166株的western-blot图；其中，泳道1：27714株猪
肺炎支原体菌体蛋白；泳道2：DJ-166株猪肺炎支原体菌体蛋白。
具体实施方式
[0018]本发明下述实施例所述猪肺炎支原体DJ-166株是从山西发病猪肺脏分离，经过2次亚克隆而来，菌种免疫原性好，制备疫苗后免疫猪保护率80%以上，保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCC No.4545。
[0019]实施例1猪肺炎支原体DJ166株灭活疫苗的制备
本实施例中，所述猪肺炎支原体DJ-166接种于改良的CH液体培养基中进行培养，所述CH液体培养基具体成分包括：
A液：脑心浸出液2.0g、PPLO肉汤5.0g、去离子水300ml以上成分混合，搅拌，使之完全溶解，116℃高压灭菌20分钟，冷却后备用；
B液：10×Hank’s液5.0ml、乳清蛋白水解物1.0g、酵母浸出液5.0g、丙酮酸钠0.8g，蛋白胨3.0g、硫代硫酸钠0.1g、0.1%酚红、青霉素400U/ml、去离子水545ml。以上各成分混合、搅拌，使之完全，用0.22um滤膜过滤除菌，4℃保存备用：
C液：健康马血清140ml；
将上述A液、B液和C液充分混合均匀，1mol/L氢氧化钠pH至7.6，制得猪肺炎支原体改良CH液体培养基。
[0020]水相制备：取猪肺炎支原体DJ-166种子按8%-10%的量接种于上述改良的CH液体培养基中，
置37℃发酵罐20%通氧量培养3-4日，待培养基颜变黄、呈轻度浑浊，pH值降至6.5-6.8时收获菌液；将收获的菌液进行活菌计数，活菌滴度不低于1010CCU/ml；50KD膜包浓缩至原体积的1/10，再以10000r/min、4℃离心60分钟，沉淀菌体用Tris-NaCl（pH7.2-7.4）缓冲液悬浮，离心洗涤3次，制成原培养物体积1/100菌悬液；将浓缩纯化菌悬液加入1.0%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%，混合均匀，置2-8℃灭活12小时。用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定，1/100浓缩菌液蛋白浓度应≥4mg/ml，将半抗原稀释成300ug/ml。
[0021]油相制备：矿物油佐剂装入灭菌瓶内，121℃灭菌 30分钟，冷却后备用。先将 1份油相加入剪切
机内，在低速搅拌的同时缓缓加入1份量的水相，以10000r/min搅拌5-8分钟，即成乳白油乳剂灭活疫苗。
[0022]实施例2血清制备
本实施例所述抗猪肺炎支原体高免血清的制备方法，包括如下步骤：
（1）免疫：取健康兔6只，分别肌肉注射上述实施例2中制得猪肺炎支原体灭活疫苗，3.0ml/只；具体的，第一次免疫：肌肉注射共3ml；第二次免疫：在第一次免疫后14日进行，免疫剂量3ml，分两点注射；第三次免疫：在第二次免疫后14日进行，免疫剂量3ml，分两点注射；
（2）采血：于免疫完成后14-21天，检测抗体效价，当所述琼扩抗体效价≥1：16时即为效价合格，可对大白兔进行心脏采血；
（3）血清纯化：将采集的兔血置37℃培养箱孵育1小时，2-8℃放置4小时，经3000r/min 离心10分钟，分离并收集血清，备用；
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