(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811093371.3
(22)申请日 2018.09.19
(71)申请人 南开大学
地址 300071 天津市南开区卫津路94号
(72)发明人 周红刚 李宵鹤 吕紫薇
(74)专利代理机构 天津滨海科纬知识产权代理
有限公司 12211
代理人 李纳
(51)Int.Cl.
A61K 31/4709(2006.01)
A61P 11/00(2006.01)
(54)发明名称
物中的应用
(57)摘要
本发明属于医药技术领域，提供了盐酸安罗
替尼的一种新用途，具体为在制备肺纤维化
包含盐酸安罗替尼及盐酸安罗替尼在药学上可
接受的盐、酯、水合物或它们的组合以及辅料。本
发明中盐酸安罗替尼对肺纤维化有良好的功效，
化，为、缓解或改善肺纤维化疾病提供良好
的应用前景。权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 108992444 A 2018.12.14
C N 108992444
A
1.盐酸安罗替尼在制备肺纤维化药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述盐酸安罗替尼是在制备特发性肺纤维化药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述盐酸安罗替尼可抑制TGF -β1/Smad3信号通路。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述盐酸安罗替尼的动物实验用量为3mg/kg，细胞实验用药浓度为100nmol/l、200nmol/l或300nmol/l。
5.一种药物组合物，其特征在于：包含盐酸安罗替尼及盐酸安罗替尼在药学上可接受的盐、酯、水合物
或它们的组合以及辅料。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物选自片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、气雾剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、注射剂、糖浆剂、酒剂、酊剂、露剂、膜剂或它们的组合。
7.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的给药方式包括口服、注射、植入、外用、喷雾、吸入或它们的组合。
8.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物是采用常规或特殊制剂工艺制备而成的。
权 利 要 求 书1/1页CN 108992444 A
盐酸安罗替尼在制备肺纤维化疾病药物中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种盐酸安罗替尼的新用途，具体涉及盐酸安罗替尼在制备肺纤维化疾病药物中的应用。
背景技术
[0002]随着环境污染问题的加剧，空气质量不断下降，雾霾增多，导致肺部疾病发病率持续升高。肺纤维化(pulmonaryfibrosis，PF)是许多病因各异的肺间质疾病的终末期临床表现，是以肺泡持续性损伤、成纤维细胞增殖及大量细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)沉积，从而导致肺泡和肺间质出现不同程度的炎症和纤维化，进而导致肺结构破坏和，所以也称间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)或弥漫性实质性肺疾病(diffuse parenchymal lung disease，DPLD)。
[0003]特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)属于间质性肺疾病(ILDs)家族中的特发性间质性肺炎(IIP)组。IPF是一种病因不明的最常见的而且最严重的慢性炎症性间质性肺疾病，临床上表现为进行性呼吸困难伴刺激性干咳，病情常持续进展，中位生存期约为2.8年，5年生存率不足50％，患者多死于和继发肺部感染。世界各地均有报道，近年来其发病率呈不断上升趋势且无明显地理和种族差别，多为中老年人，常在50～70岁发病，儿童发病罕见。鉴于大量的临床情况，IPF的患病率和发病率很难估计，100000中有15-250的概率发生，根据国家、年龄、性别不同，每年有34000个新发病例。目前肺移植是唯一可延长肺纤维化患者生存期的手段，特发性肺纤维化诊断和中国专家共识指南推荐的IPF药物主要包括吡非尼酮、尼达尼布、抗酸药物、N-乙酰半胱氨酸，其中获批的有效IPF的药物仅有吡非尼酮、尼达尼布。虽然这些药物可以延缓肺功能下降速度，但不能逆转病情进展，而且相当一部分患者对反应欠佳，其具体药理机制尚未完全清楚。因此阐明肺纤维化的发生发展机制，探索新的潜在的药物靶点，开发出针对肺纤维化的疗效确认、相对安全、价格合理的药物具有重要的社会意义和医学意义。
[0004]尽管目前对于肺纤维化的发病机制尚不十分明确，但有证据表明，细胞因子在肺纤维化的发生发展中起着关键作用，它们之间相互调控、相互制约，构成了复杂的细胞因子网络，共同参与肺纤维化进程。而TGF-β1是现在已知最强的促ECM积聚诱导因子，是肺纤维化形成的关键因子，是目前研究的最为深入、作用最重要的细胞因子，已被大多数学者公认为是参与肺纤维化进展的关键性细胞因子，参与肺纤维化发生发展的多个环节。在IPF患者中，TGF-β1主要由肺巨噬细胞、肺泡上皮细胞等分泌，可通过依赖Smad和非依赖Smad的方式诱导肺泡上皮细胞发生上皮间质转化，刺激成纤维细胞增殖，促进肌成纤维细胞形成以及胶原的产生。其中主要是以依赖Smad的方式发挥作用，TGF-β1与肺成纤维细胞膜上的TGF-βⅠ型受体(TGF-βRⅠ)、TGF-βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)结合形成三聚体复合物，细胞内TGF-β1的下游信号通路Smads家族蛋白信号转导通路被激活，Smad2、3被磷酸化，活化的Smad2、3与TGF-βRⅠ受体分离转而同Smad4结合形成三聚体，共同迁移到细胞核，间接或直接与靶基因结合以调节TGF-β1因子的转录活性。同时激活核内ECM成分如纤维黏连蛋白、胶原等启动子的活
性，从而促进ECM成分的合成。
[0005]盐酸安罗替尼，是一种新型小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，能够有效抑制VEGFR、PDGFR、FGFR、c-Kit等激酶，具有抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤生长的作用，2018年5月获CFDA批准上市，用于晚期非小细胞肺癌。截至目前，尚无盐酸安罗替尼可减缓肺纤维化的相关报道。盐酸安罗替尼的结构式如下：
[0006]
发明内容
[0007]有鉴于此，本发明旨在提供一种盐酸安罗替尼的新用途，即盐酸安罗替尼在制备肺纤维化疾病药物中的应用。
[0008]进一步的，所述盐酸安罗替尼是在制备特发性肺纤维化药物中的应用。[0009]进一步的，所述盐酸安罗替尼可抑制TGF-β1/Smad3信号通路。
[0010]进一步的，所述盐酸安罗替尼的动物实验用量为3mg/kg，细胞实验用药浓度为100nmol/l、200nmol/l或300nmol/l。
[0011]本发明还提供一种药物组合物，包含盐酸安罗替尼及盐酸安罗替尼在药学上可接受的盐、酯、水合物或它们的组合以及辅料。
[0012]进一步的，所述药物组合物选自片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、气雾剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、注射剂、糖浆剂、酒剂、酊剂、露剂、膜剂或它们的组合。
[0013]进一步的，所述药物组合物的给药方式包括口服、注射、植入、外用、喷雾、吸入或它们的组合。
[0014]进一步的，所述药物组合物是采用常规或特殊制剂工艺制备而成的。
[0015]相对于现有技术，本发明具有以下优势：
[0016]本发明提供了一种盐酸安罗替尼的新用途，即盐酸安罗替尼在制备肺纤维化疾病药物中的应用。本发明中盐酸安罗替尼对肺纤维化有良好的功效，无不良反应，可减缓博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化，为、缓解或改善肺纤维化疾病提供良好的应用前景。
附图说明
[0017]图1为荧光素酶报告基因检测(Luciferase assay)法检测盐酸安罗替尼抑制TGF-β1/Smad3信号表达的结果；
[0018]图2为蛋白质印迹法(Western Blot)检测盐酸安罗替尼抑制TGF-β1诱导的Smad3磷酸化结果；
[0019]图3为盐酸安罗替尼给药组小鼠体重变化图；
[0020]图4为盐酸安罗替尼改善博来霉素诱导后小鼠肺功能参数图；
[0021]图5为盐酸安罗替尼减少博莱霉素诱导后小鼠肺部胶原含量(*，p<0.05，即统计学上具有显著性差异)；
[0022]图6为盐酸安罗替尼减少博莱霉素诱导后小鼠肺纤维化面积。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0024]实施例一：在小鼠胚胎肺成纤维细胞系(NIH3T3)中，盐酸安罗替尼梯度依赖性抑制TGF-β1/Smad3信号通路。
[0025]萤光素酶基因检测法(Luciferase assay)：利用实验室已成功构建的稳定转染TGF-β1/Smad3信号通路报告基因质粒的CAGA-NIH3T3细胞系检测盐酸安罗替尼对TGF-β1/ Smad3信号通路的影响。待CAGA-NIH3T3细胞汇合度达80％左右时将其铺于96孔板内，待96孔板中的细胞达到80％左右则将含有10％FBS的DMEM换成含1‰FBS的DMEM。适当时间后，将原培养基弃掉，加盐酸安罗替尼(浓度为100nmol/l、200nmol/l、300nmol/l)和TGF-β1(5ng/ ml)共同刺激18h。弃掉原培养基，用PBS洗后加入细胞裂解液，每孔50μl，加后震摇30min。将上述裂解液转至白板对应孔中，每孔转35μl，转后加入40μl底物进行检测，检测结果如图1所示，结果显示盐酸安罗替尼可以梯度依赖性抑制TGF-β1/Smad3信号通路的表达。[0026]蛋白质印迹法(Western blot)：当NIH3T3细胞汇合度达到80％～90％时，加入盐酸安罗替尼(浓度为100nmol/l、300nmol/l)作用2h后，加入TGF-β1(5ng/ml)刺激30min。使用蛋白裂解液提取蛋白质，然后样品加入适量4×Loading buffer，100℃煮3min，SDS-PAGE 电泳后电转移至PVDF膜上。5％脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入1：1 000p-Smad3、1：2 000GAPDH一抗，4℃反应过夜，TBST洗涤3次，每次10min，加入1∶3 000辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2h，TBST洗涤3次，每次1
0min，利用化学发光成像仪得到曝光条带，如图2所示，结果显示盐酸安罗替尼可梯度依赖性抑制TGF-β1诱导的Smad3磷酸化。
[0027]实施例二：盐酸安罗替尼减缓博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化。
[0028]动物模型制备：雄性C57BL/6J，(周龄8-10周)野生型小鼠，以10％水合氯醛按0.5ml/100g给予小鼠腹腔注射麻醉，气管内有创注射2U/Kg博莱霉素。具体实施方式如下：麻醉小鼠后称重记录，将小鼠固定于操作台，颈部用70％酒精消毒，用手术刀在小鼠颈部垂直划开大约1cm长创口，利用显微镊分离组织暴露气管，将注射器经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，然后按2U/kg的计量缓慢注入与其体重相适应体积的博莱霉素生理盐水溶液，立即将动物直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布。空白对照组注射同体积的生理盐水(0.9％Nacl)。
[0029]分组给药：盐酸安罗替尼是指在博莱霉素处理第7-14天时，每天通过灌胃给予小鼠3mg/kg盐酸安罗替尼，以相应溶剂生理盐水作为对照，博莱霉素处理14天后检测肺胶原含量及纤维化严重程度。
[0030]肺功能检测：在博来霉素注射第14天时，10％水合氯醛按腹腔注射麻醉小鼠(0.5ml/100g)，取仰卧位固定于操作台，剪开颈部皮毛，暴露气管，并钝性分离气管，于气管近头部处剪一切口，将插管的气管接头处插入气管，并用棉线固定，转移小鼠至体描仪平
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