(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811492897.9
(22)申请日 2018.12.07
(71)申请人 中国农业大学
地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号
(72)发明人 赵丽红 马秋刚 计成 郭永鹏
(74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理
有限公司 11246
代理人 陈波
(51)Int.Cl.
A23L 5/20(2016.01)
C12N 9/02(2006.01)
(54)发明名称
用
(57)摘要
本发明涉及酶工程技术领域的细菌漆酶
CotA蛋白在降解霉菌毒素中的应用，尤其涉及同
发明通过实验证实细菌漆酶CotA蛋白能够不依
赖任何介体同时降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯
酮。
权利要求书2页 说明书9页序列表3页 附图2页CN 109820132 A 2019.05.31
C N 109820132
A
1.细菌漆酶CotA蛋白在降解霉菌毒素上的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的霉菌毒素为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1或M2、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯醇和玉米赤霉醇。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细菌漆酶CotA蛋白来源于芽孢杆菌，所述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)或克劳氏芽胞杆菌(Bacillus clausii)，优选为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。 4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细菌漆酶CotA蛋白的氨基酸序列为：
SEQ ID NO.1所示序列；
或者SEQ ID NO.1所示序列中的一个或两个氨基酸残基被取代和/或缺失和/或插入；
或者与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％以上的序列一致性，并具有细菌漆酶CotA蛋白的功能的序列。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述细菌漆酶CotA蛋白的核苷酸序列为：
SED ID NO.2所示序列；
或者SED ID NO.2所示序列中的一个或两个核苷酸残基被取代和/或缺失和/或插入；
或者与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少90％以上的序列一致性。
6.一种食品或饲料添加剂，其特征在于，包含细菌漆酶CotA蛋白以及其生理上可接受的载体，所述细菌漆酶CotA蛋白的含量为1-10％。
7.根据权利要求6所述的添加剂，其特征在于，所述生理上可接受的载体选自麦芽糖糊精、石灰石、环糊精、小麦、麦麸、稻米、米糠、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉和PVA中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的添加剂，其特征在于，还含有微生态制剂，所述微生态制剂为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中的一种或多种，优选的，所述添加剂在用于青贮饲料或牛饲料时，还含有产丙酸杆菌、布氏乳杆菌和副干酪乳杆菌中的至少一种；或者
所述添加剂在用于禽类、猪和水产养殖动物的饲料时，还含有凝结芽孢杆菌和/或侧孢短芽孢杆菌。
9.根据权利要求6所述的添加剂，其特征在于，所述添加剂还包括另外的酶；所述另外的酶选自：黄曲霉毒素去毒酶、玉米赤霉烯酮内酯酶、伏马毒素羧基酯酶、伏马毒素氨基转移酶、氨基多元醇胺氧化酶、脱氧瓜萎镰菌醇环氧化物水解酶、羧肽酶、黑曲霉天冬氨酸蛋白酶PEPAa、PEPAb、PEPAc或PEPAd，弹性蛋白酶、氨基肽酶、胃蛋白酶、胃蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、细菌蛋白酶、涉及淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的酶、涉及糖原代谢的蛋白质或酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、表异构酶、酯酶、-半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶，葡糖苷酶，包括β-葡糖苷酶，葡糖醛酸酶、
半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、脂解酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解、果胶乙酰酯酶、果胶去聚合酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、非洲甜果素、转移酶、转运蛋白、转谷酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶和酸性磷酸酶中的一种或多种。
10.一种降解霉菌毒素的方法，其特征在于，包括步骤如下：
将细菌漆酶CotA蛋白或权利要求6-9任一项所述的添加剂处理含有霉菌毒素的材料。
细菌漆酶CotA蛋白在降解霉菌毒素中的应用
技术领域
[0001]本发明属于酶工程技术领域，具体涉及细菌漆酶CotA蛋白在降解霉菌毒素中的应用，特别是同时降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮中的应用。
背景技术
[0002]霉菌毒素是霉菌的次级代谢产物，具有致癌作用、遗传毒性、生殖毒性、神经毒性和免疫抑制作用，动物采食霉变日粮后会出现生长抑制、疾病易感性增加、代谢紊乱、繁殖障碍等霉菌毒素中毒症状，另外霉菌毒素代谢产物可以残留在动物源性食品中，通过食物链进入人体威胁人类健康。粮食谷物在田间就会感染产毒素霉菌，如果环境温度、湿度适宜，在加工、运输、储存过程中霉菌会继续生长繁殖，毒素含量会继续增加。据国际粮农组织(FAO)估计，全世界每年有25％的谷物受到霉菌毒素污染，平均有2％不能食用，加之因毒素污染导致的人和动物中毒、疾病和死亡，造成的社会经济损失难以估量。黄曲霉毒素主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，其中黄曲霉毒素B1的毒性和危害最大，黄曲霉毒素B1急性毒性是的10倍，的68倍，其分子结构中双呋喃环及氧杂奈邻酮环与其毒性及致癌性密切相关。玉米赤霉烯酮又称F-2毒素，是一种主要由禾谷镰刀菌产生的非类固醇类、具有雌激素作用的霉菌毒素，化学名为6-(10-羟基-6-氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内脂，其中内酯键和苯环C4号位上的羟基是玉
米赤霉烯酮的主要毒性基团。
[0003]霉菌毒素生物降解是指在微生物及其产生的特效酶的作用下将霉菌毒素转化成无毒或低毒的代谢产物，具有安全、高效和环保等优点，是当下饲料和食品中霉菌毒素脱毒的发展趋势。目前国内外报道的能够降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的酶主要是过氧化物酶，如辣根过氧化物酶、锰过氧化物酶等，此外来源于真菌的漆酶也被报道具有降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮活性。过氧化物酶在催化降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮过程中需要以过氧化氢为底物，真菌漆酶催化降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮需要介体的参与，因此过氧化物酶和真菌漆酶用于饲料和食品中霉菌毒素脱毒有效性和安全性亟需进一步评估。此外，具有黄曲霉毒素降解活性的蛋白还包括来源于假蜜环菌的黄曲霉毒素氧化酶ADTZ以及来源于分枝杆菌的F420H2依赖还原酶FDR；具有玉米赤霉烯酮降解活性的蛋白还包括来源于红粉粘帚霉的内酯水解酶ZHD101以及来源于葡萄顶枯病菌的玉米赤霉烯酮降解酶ZENdease-N2。
[0004]越来越多证据表明，其他性质未明的酶也可能参与降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮这两种具有苯环和内酯环结构的霉菌毒素。因此，寻和开发新的酶类，用于霉菌毒素的生物降解势在必行。
发明内容
[0005]本发明的目的在于提供细菌漆酶CotA蛋白在霉菌毒素脱毒中的应用。用于谷物、粮食、饲料、食品、水果、牛奶等及其加工副产物、工业乙醇加工副产物DDGS等材料中霉菌毒素脱毒。
[0006]为此，本发明的技术方案如下：
[0007]细菌漆酶CotA蛋白在降解霉菌毒素上的应用，所述的霉菌毒素为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1或M2、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯醇和玉米赤霉醇。
[0008]上述应用中，所述细菌漆酶CotA蛋白来源于芽孢杆菌。
[0009]上述应用中，所述芽孢杆菌可以为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)或克劳氏芽胞杆菌(Bacillus clausii)，优选为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
[0010]上述应用中，其中所述细菌漆酶CotA蛋白的氨基酸序列可以为：
[0011]SEQ ID NO.1所示序列；
[0012]或者SEQ ID NO.1所示序列中的一个或两个氨基酸残基被取代和/或缺失和/或插入；
[0013]或者与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％以上的序列一致性，并具有细菌漆酶CotA蛋白的功能的序列。
[0014]上述应用中，编码所述细菌漆酶CotA蛋白的核苷酸序列为：
[0015]SED ID NO.2所示序列；
[0016]或者SED ID NO.2所示序列中的一个或两个核苷酸残基被取代和/或缺失和/或插入；
[0017]或者与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少90％以上的序列一致性。[0018]一种食品或饲料添加剂，包含细菌漆酶CotA蛋白以及生理上可接受的载体，所述漆酶CotA蛋白的含量为1-10％。
[0019]所述生理上可接受的载体选自麦芽糖糊精、石灰石、环糊精、小麦、麦麸、稻米、米糠、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉和PVA中的一种或多种。
[0020]上述添加剂中，细菌漆酶CotA蛋白的氨基酸序列可以为：
[0021]SEQ ID NO.1所示序列；
[0022]或者SEQ ID NO.1所示序列中的一个或两个氨基酸残基被取代和/或缺失和/或插入；
[0023]或者与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％以上的序列一致性，并具有细菌漆酶CotA蛋白的功能的序列。
[0024]上述添加剂中，还包括微生态制剂，所述微生态制剂为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧
杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中的一种或多种，优选的，所述添加剂在用于青贮饲料或牛饲料时，还含有产丙酸杆菌、布氏乳杆菌和副干酪乳杆菌中的至少一种；或者所述添加剂在用于禽类、猪和水产养殖动物的饲料时，还含有凝结芽孢杆菌和/或侧孢短芽孢杆菌。
[0025]上述添加剂中，所述添加剂还包括另外的酶；所述另外的酶选自：黄曲霉毒素去毒酶、玉米赤霉烯酮内酯酶、伏马毒素羧基酯酶、伏马毒素氨基转移酶、氨基多元醇胺氧化酶、
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