(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911013063.X
(22)申请日 2019.10.23
(71)申请人 中山大学肿瘤防治中心（中山大学
附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究
所）
地址 510060 广东省广州市越秀区东风东
路651号
(72)发明人 王自峰 刘强 唐照 雷鑫星
穆罕默德·卡姆兰·拉贾 刘芳
刘美玲 张海亮
(74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有
限公司 44205
代理人 许飞
(51)Int.Cl.
C12Q 1/66(2006.01)
G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了基于nanoBRET的促蛋白泛素
化降解药物筛选系统及方法。筛选系统包括：荧
光蛋白修饰的泛素表达质粒，用于表达荧光蛋白
修饰的泛素；内源性泛素基因UBB及UBC敲除的细
胞系；以及靶蛋白-荧光素酶融合蛋白。本发明的
一些实例，避免了每次检测前18小时加入小分子
荧光底物，同时也避免了小分子荧光底物对细胞
造成的毒性影响，使用方便，可以实时监测活细
胞中靶蛋白的泛素化水平，结果更加可靠，可以
直观反映待筛选化合物对靶蛋白的影响，利于促
蛋白泛素化降解药物的高通量筛选。
权利要求书1页 说明书6页序列表2页 附图2页CN 110835641 A 2020.02.25
C N 110835641
A
1.一种基于生物发光共振能量转移的促蛋白泛素化降解药物筛选系统，包括：
荧光蛋白修饰的泛素表达质粒，用于表达荧光蛋白修饰的泛素；
内源性泛素基因UBB及UBC敲除的细胞系；以及
靶蛋白-荧光素酶融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的促蛋白泛素化降解药物筛选系统，其特征在于：所述荧光蛋白为长斯托克位移蛋白LSSmOrange。
3.根据权利要求1所述的促蛋白泛素化降解药物筛选系统，其特征在于：所述泛素包括野生型和突变型泛素。
4.根据权利要求3所述的促蛋白泛素化降解药物筛选系统，其特征在于：所述突变型泛素包括K6,K11,K27,K29,K33,K48和K63型泛素。
5.根据权利要求1所述的促蛋白泛素化降解药物筛选系统，其特征在于：所述靶蛋白-荧光素酶融合蛋白以表达质粒的方式引入。
6.根据权利要求1或5所述的促蛋白泛素化降解药物筛选系统，其特征在于：所述荧光素酶为 luciferase。
7.根据权利要求1～5任一项所述的促蛋白泛素化降解药物筛选系统，其特征在于：所述促蛋白泛素化降解药物筛选系统还添加有蛋白酶体抑制剂。
8.根据权利要求1所述的促蛋白泛素化降解药物筛选系统，其特征在于：所述蛋白酶体抑制剂选自MG132。
9.根据权利要求1～5任一项所述的促蛋白泛素化降解药物筛选系统，其特征在于：荧光蛋白修饰在泛素的N端。
10.一种促蛋白泛素化降解药物的筛选方法，其筛选系统如权利要求1～9任一项所述，其筛选步骤包括：
1)将荧光蛋白修饰的泛素表达质粒、靶蛋白-荧光素酶融合蛋白或其表达质粒转转入内源性泛素基因UBB及UBC敲除的细胞系并表达；
2)加入待筛选化合物及荧光素酶底物，检测其作用后的荧光值；
3)比较不同处理的荧光值差异，确定化合物和/或靶蛋白是否可以促蛋白泛素化降解。
权 利 要 求 书1/1页CN 110835641 A
基于nanoBRET的促蛋白泛素化降解药物筛选系统及方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种药物筛选系统及方法。
背景技术
[0002]泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80％以上蛋白质的降解。该系统包括由泛素(ubiquitin,Ub)、泛素活化酶(ubiquitin activating enzyme,E1)、泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme,E2)、泛素连接酶(ubiquitin protein ligase,E3)、蛋白酶体及其底物(蛋白质)构成。其中：
[0003]①泛素：含有76个氨基酸残基，分子量约8.5kDa，广泛存在于真核细胞。泛素链与蛋白底物的结合形成被蛋白酶体降解的识别信号。另外，泛素化在蛋白的内吞和外泌作用中有目标定位功能。
[0004]泛素分子全长包含7个赖氨酸位点(K6,K11,K27,K29,K33,K48和K63)和1个位于C 端的甘氨酸(Gly)位点以及位于N端的甲硫氨酸(Met1)位点。根据现有研究，无论在细胞内环境还是胞外反应体系，泛素自身的每个赖氨酸位点以及N端的甲硫氨酸(Met1)位点都可以发生泛素化从而延伸泛素链。其中对K48和K63位多聚泛素化的研究最广泛，而其他类型的泛素化链研究较少且被认为是非典型泛素化。但是随着对泛素化链的装配、识别以及水解的深入研究，非典型泛素化的功能与意义也逐渐得到了重视。
[0005]②泛素活化酶E1：通过半胱氨酸残基与泛素C端活化的甘氨酸残基形成硫酯键，E1-泛素中间体中的泛素可以转移给数个E2。
[0006]③泛素结合酶E2：以泛素结合酶方式起作用，活性部位为半胱氨酸，部分E2成员在细胞特定过程中发挥作用，但E2的全部作用尚不清楚。
[0007]④泛素连接酶E3：为泛素-蛋白酶体系统选择性降解机制的关键因素，识别被降解的蛋白并将泛素连接到底物上。
[0008]⑤蛋白酶体(2.5MDa)：由2个19S和1个20S亚单位组成的桶状结构，19S为调节亚单位，位于桶状结构的两端，识别多聚泛素化蛋白并使其去折叠。19S亚单位上还具有一种去泛素化的同功肽酶，使底物去泛素化。20S为催化亚单位，位于两个19S亚单位的中间，其活性部位处于桶状结构的内表面，可避免细胞环境的影响。
[0009]泛素-蛋白酶体系统降解蛋白是一个多步骤反应过程，有多种不同蛋白质参与。需要被蛋白酶体降解的蛋白质会先被连接上泛素作为标记，即蛋白质上的一个赖氨酸与泛素之间形成共价连接。这一过程是一个三酶级联反应，即需要有由三个酶催化的一系列反应的发生，整个过程被称为泛素化信号通路。在第一步反应中，泛素活化酶(又被称为E1)水解ATP并将一个泛素分子腺苷酸化。接着，泛素被转移到E1的活性中心的半胱氨酸残基上，并伴随着第二个泛素分子的腺苷酸化。被腺苷酸化的泛素分子接着被转移到第二个酶，泛素交联酶(E2)的半胱氨酸残基上。最后，高度保守的泛素连接酶(E3)家族中的一员(根据底物蛋白质的不同而不同)识别特定的需要被泛素化的靶蛋白，并催化泛素分子从E2上转移到
靶蛋白上。靶蛋白在被蛋白酶体识别之前，必须被标记上至少四个泛素单体分子(以多泛素链的形式)。因此，是E3使得这一系统具有了底物特异性。E1、E2和E3蛋白的数量依赖于生物体和细胞类型，人体中就存在大量不同的E3蛋白，这说明泛素-蛋白酶体系统可以作用于数量巨大的靶蛋白。泛素受体蛋白的N末端具有一个类泛素结构域，以及一至多个泛素结合结构域。类泛素结构域可以被19S调节颗粒所识别，而泛素结合结构域可以通过形成三螺旋束来结合泛素。这些受体蛋白可能能够结合多泛素化的蛋白质并将其携带到蛋白酶体降解。[0010]泛素-蛋白酶体系统是细胞内一系列生命进程的重要调节方式。在细胞内，绝大多数蛋白质都是通过泛素-蛋白酶体系统分解的。泛素-蛋白酶体系统主要起两方面的作用：一是通过分解异常或损伤的蛋白质以维持细胞的质量；二是通过分解特定功能的蛋白质来控制细胞的基本生命活动；两者最终保障组织和器官功能的正常发挥。泛素-蛋白酶体系统参与细胞的生长、分化，DNA复制与修复，细胞代谢、免疫反应等重要生理生化过程。[0011]整个泛素-蛋白酶体系统涉及诸多控制节点，当这些控制节点都处于正常状态时，细胞内各种蛋白质的分解以保证机体各项功能高效发挥为原则，始终维持在一个动态的平衡状态之中。泛素-蛋白酶体系统功能紊乱是指动态平衡被打破，细胞内蛋白质代谢失衡所导致一系列外在疾病的最内在紊乱。针对泛素-蛋白酶体系统进行药物设计，可能是会带来药物开发的新优势。
[0012]在基础研究及药物研发中，经常需要检测细胞内蛋白质的泛素化修饰水平，包括野生型泛素化修饰(WT)，及各种特异性的泛素化修饰(K6,K11,K27,K29,K33,K48和K63)。目前的检测技术主要是通过W
estern blot技术进行半定量检测。该技术需要裂解细胞提取蛋白，然后进行电泳和免疫杂交，耗费时间长，检测通量低。现有技术中缺乏行之有效的促蛋白泛素化降解药物的筛选系统。
[0013]生物发光共振能量转移(Bioluminescence resonance energy transfer,BRET)是一项检测细胞内蛋白相互作用的技术。当两个蛋白分子相互作用，一个蛋白融合表达的供体萤光素酶蛋白酶学反应产生的的发光信号光谱与另一个蛋白标记的受体荧光基团的激发光谱相重叠，诱发受体分子发出荧光。
[0014]传统的BRET平台使用的是海肾荧光素酶(RLuc)作为能量供体，黄荧光蛋白(YFP)作为能量受体。相对于荧光能量共振转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术，BRET技术检测蛋白质相互作用无需激发光，无需漂白，对细胞损坏更少，数据窗口更宽。但这一体系有两个缺点：1)RLuc光输出量太低，导致BRET效率低，难以检测。2)RLuc和YFP的光谱非常接近(即光谱重叠比较高)，因此产生了较高的背景，这种高背景增加了检测噪音，也降低了灵敏度和动态范围。
[0015]针对上述缺点，Promega公司对BRET方法进行大幅改良。主要包含：1)使用
萤光素酶替代Rluc萤光素酶作为能量供体。NanoLuc TM萤光素酶由Promega公司的研究科学家利用定向进化技术开发。它具有分子量更小(19.1kDa，171个氨基酸)，比萤火虫(Photinus pyralis)或海肾(Renil
lareniformis)萤光素酶的发光高两个数量级。2)使用蛋白标记的NanoBRET TM 618荧光基团作为能量受体替代YFP。NanoBRET TM 618荧光基团具有更大的斯托克位移(Stoke’s shift)。斯托克位移即吸收波长和发射波长的最大值(主峰)之差。斯托克位移越大，激发光和发射光之间的分离就越大。斯托克斯位移是荧光技术灵敏度的基础。因此，NanoLuc供体的明亮的蓝移发光信号耦合到远红移的
HaloTag受体上后，光谱叠加更佳、信号更强、且与传统BRET分析相比背景更低。有了这些特性，许多NanoBRET实验使用Nluc来检测活细胞内的蛋白相互作用或者用于筛选药物。[0016]尽管NanoBRET有了很大的提升，但也存明显的缺点：NanoBRET TM 618荧光基团为promega公司特有专利，价格昂贵。且该技术需要提前18小时左右加入NanoBRET TM 618荧光基团底物，对细胞具有一定的毒性。
发明内容
[0017]本发明的目的在于提供一种基于荧光的促蛋白泛素化降解药物筛选系统及方法。[0018]本发明所采取的技术方案是：
[0019]本发明的第一个方面，提供：
[0020]一种基于生物发光共振能量转移的促蛋白泛素化降解药物筛选系统，包括：[0021]荧光蛋白修饰的泛素表达质粒，用于表达荧光蛋白修饰的泛素；
[0022]内源性泛素基因UBB及UBC敲除的细胞系；以及
[0023]靶蛋白-荧光素酶融合蛋白。
[0024]在一些促蛋白泛素化降解药物筛选系统的实例中，所述荧光蛋白为长斯托克位移蛋白LSSmOrange。
[0025]在一些促蛋白泛素化降解药物筛选系统的实例中，所述泛素包括野生型和突变型泛素。
[0026]在一些促蛋白泛素化降解药物筛选系统的实例中，所述突变型泛素包括K6,K11, K27,K29,K33,K48和K63型泛素。
[0027]在一些促蛋白泛素化降解药物筛选系统的实例中，所述靶蛋白-荧光素酶融合蛋白以表达质粒的方式引入。
[0028]在一些促蛋白泛素化降解药物筛选系统的实例中，所述荧光素酶为luciferase。
[0029]在一些促蛋白泛素化降解药物筛选系统的实例中，所述促蛋白泛素化降解药物筛选系统还添加有蛋白酶体抑制剂。
[0030]在一些促蛋白泛素化降解药物筛选系统的实例中，所述蛋白酶体抑制剂选自MG132。
[0031]在一些促蛋白泛素化降解药物筛选系统的实例中，荧光蛋白修饰在泛素的N端。[0032]本发明的第二个方面，提供：
[0033]一种促蛋白泛素化降解药物的筛选方法，其筛选系统本发明的第一个方面所述，其筛选步骤包括：
[0034]1)将荧光蛋白修饰的泛素表达质粒、靶蛋白-荧光素酶融合蛋白或其表达质粒转转入内源性泛素基因UBB及UBC敲除的细胞系并表达；
[0035]2)加入待筛选化合物及荧光素酶底物，检测其作用后的荧光值；
[0036]3)比较不同处理的荧光值差异，确定化合物和/或靶蛋白是否可以促蛋白泛素化降解。
[0037]本发明的有益效果是：
[0038]本发明的一些实例，避免了每次检测前18小时加入小分子荧光底物，同时也避免
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