(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811268305.5
(22)申请日 2018.10.29
(71)申请人 中国药科大学
地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大
道639号
(72)发明人 陈贵堂 廖登未 黄德春 程抒劼
曹崇江
(74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所
(普通合伙) 32204
代理人 郑立发
(51)Int.Cl.
C08B 37/00(2006.01)
A61K 31/715(2006.01)
A61P 35/00(2006.01)
(54)发明名称一种具有抗肿瘤活性的生姜多糖及其应用(57)摘要本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的生姜多糖，其主要由以下步骤分离纯化所得：(1)取生姜粉，加入10-35倍质量蒸馏水，置于冰浴中超声提取；(2)将提取液依次进行离心、过滤、浓缩、除蛋白和醇沉，对醇沉物进行洗涤后，用蒸馏水复溶，进行真空冷冻干燥，得生姜粗多糖；(3)将生姜粗多糖采用纤维素阴离子交换层析柱上样与洗脱；(4)将上述洗脱后样品采用葡聚糖凝胶层析柱上样与洗脱，即得所述生姜多糖。本发明采用超声波冰浴法，经过分离纯化，得到一种对肿瘤有较强抑制作用的多糖UIP1，为今后在食品、医药等实际生产应用中奠定了坚实的基础。同时本发明实验操作简单，且效率高，所获得多糖药理活性高， 可应用于大规模的工业生产。权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 109400739 A 2019.03.01
C N 109400739
A
1.一种具有抗肿瘤活性的生姜多糖，其特征在于，其主要由以下步骤分离纯化所得：
(1)取生姜粉，加入10-35倍质量蒸馏水，置于冰浴中超声提取；
(2)将提取液依次进行离心、过滤、浓缩、除蛋白和醇沉，对醇沉物进行洗涤后，用蒸馏水复溶，进行真空冷冻干燥，得生姜粗多糖；
(3)将生姜粗多糖采用纤维素阴离子交换层析柱上样与洗脱；
(4)将上述洗脱后样品采用葡聚糖凝胶层析柱上样与洗脱，即得所述生姜多糖。
2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的生姜多糖，其特征在于，步骤(1)中生姜粉为干燥的生姜粉，且加入蒸馏水之前，进行过筛处理。
3.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的生姜多糖，其特征在于，步骤(1)中超声提取的条件为：超声功率200-600W，超声时间20-45min。
4.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的生姜多糖，其特征在于，步骤(2)中浓缩采用旋蒸浓缩；除蛋白采用sevag法除蛋白。
5.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的生姜多糖，其特征在于，步骤(2)中对醇沉物进行无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤。
6.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的生姜多糖，其特征在于，步骤(3)中采用DEAE -52纤维素阴离子交换层析柱，用氯化钠溶液进行梯度洗脱，测定收集液中的多糖含量和蛋白含量，选择多糖含量和蛋白含量之差最大的组分，浓缩，透析除杂，冷冻干燥，备用。
7.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的生姜多糖，其特征在于，步骤(4)中采用Sephadex G -200葡聚糖凝胶层析柱，不同浓度的NaCl溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，测定收集液中的多糖含量和蛋白含量，选择多糖含量和蛋白含量之差最大的组分，即得所述生姜多糖。
8.权利要求1-7任一项所述的生姜多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结肠癌。
权 利 要 求 书1/1页CN 109400739 A
一种具有抗肿瘤活性的生姜多糖及其应用
技术领域
[0001]本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的生姜多糖及其应用，属于生姜多糖技术领域。
背景技术
[0002]生姜(Zingiber officinale Roscoe)，又名百辣云、姜根，传统中医认为生姜具有止咳、化痰、散寒等功效，目前主要分布于我国四川、贵州、福建、广西等地。现代科学研究表明生姜提取物具有抗氧化
、抗炎、降血脂、抑制细菌生长、抗动脉粥样硬化等作用，其中姜酮、姜酚对肿瘤均有较显著的抑制生长作用。生姜作用药食同源的代表，具有较高的药用价值，同时具有加高经济价值和开发利用前景。
[0003]生姜多糖作为一种植物多糖，具有抗氧化、抗疲劳、抗炎抗菌等药理作用。目前在生姜多糖的提取工艺中多采用传统提取方法，多糖中蛋白、核酸等物质较多，多糖纯度较低，且目前国内外尚未有研究报道生姜多糖对肿瘤具有抑制作用。
发明内容
[0004]发明目的：为解决上述技术问题，本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的生姜多糖及其应用，本发明通过特定的分离纯化方法，得到一种生姜多糖，其具有显著的抗肿瘤活性，尤其对于人结肠癌。
[0005]技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0006]一种具有抗肿瘤活性的生姜多糖，其主要由以下步骤分离纯化所得：
[0007](1)取生姜粉，加入10-35倍质量蒸馏水，置于冰浴中超声提取；
[0008](2)将提取液依次进行离心、过滤、浓缩、除蛋白和醇沉，对醇沉物进行洗涤后，用蒸馏水复溶，进行真空冷冻干燥，得生姜粗多糖；
[0009](3)将生姜粗多糖采用纤维素阴离子交换层析柱上样与洗脱；
[0010](4)将上述洗脱后样品采用葡聚糖凝胶层析柱上样与洗脱，即得所述生姜多糖。[0011]作为优选：
[0012]步骤(1)中生姜粉为干燥的生姜粉，且加入蒸馏水之前，进行过筛处理。
[0013]步骤(1)中超声提取的条件为：超声功率200-600W，超声时间20-45min。
[0014]步骤(2)中浓缩采用旋蒸浓缩；除蛋白采用sevag法除蛋白。
[0015]步骤(2)中对醇沉物进行无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤。
[0016]步骤(3)中采用DEAE-52纤维素阴离子交换层析柱，用氯化钠溶液进行梯度洗脱，测定收集液中的多糖含量和蛋白含量，选择多糖含量和蛋白含量之差最大的组分，浓缩，透析除杂，冷冻干燥，备用。
[0017]步骤(4)中采用Sephadex G-200葡聚糖凝胶层析柱，将蒸馏水过0.45μm微孔滤膜，制备成过膜水，用过膜水配制不同浓度的NaCl溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，测定收集液中的多糖含量和蛋白含量，选择多糖含量和蛋白含量之差最大的组分，即得所述生姜多糖。
[0018]所述的生姜多糖在制备抗肿瘤药物中的应用，优选，所述肿瘤为结肠癌。[0019]技术效果：相对
于现有技术，本发明采用超声波冰浴法(ultrasonic ice bath)，经过分离纯化，得到一种对肿瘤有较强抑制作用的多糖UIP1，为今后在食品、医药等实际生产应用中奠定了坚实的基础。同时本发明实验操作简单，且效率高，所获得多糖药理活性高，可应用于大规模的工业生产。
附图说明
[0020]图1：生姜多糖的DEAE-52纤维素阴离子交换层析柱洗脱曲线。
[0021]图2：生姜多糖的Sephadex G-200葡聚糖凝胶层析柱洗脱曲线。
[0022]图3：不同浓度的UIP1对HCT116细胞的抑制作用。 具体实施方式
[0023]下面结合具体实施例，对本发明进行进一步详细的说明。
[0024]实施例1生姜多糖(UICP)的分离纯化
[0025] 1.实验试剂及主要仪器
[0026] 1.1实验试剂
[0027]干姜片亳州市常富药业有限公司；PBS缓冲液(10X)、MTT(噻唑兰)、RPMI-1640不完全培养基(含双抗)南京凯基生物试剂有限公司；DMSO南京化学试剂有限公司；北美胎牛血清(FBS)Gibco公司；HCT116人结肠癌细胞中国药科大学食品教研室；其它试剂均为国产分析纯试剂。
[0028] 2.1主要仪器
[0029]ATX224型分析天平岛津(香港)有限公司；HH-42数显恒温搅拌循环水箱常州国华电器有限公司；Nikon显微镜南京江南永新光学有限公司；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台苏州净化设备厂；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；多功能酶标仪Promega公司；CO2培养箱ThermoForma公司，超低温冰箱；DFY-500型摇摆式高速中药粉碎机温岭市林大机械有限公司；TU-1901型紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；LXJ-IIB型离心机上海安亭科学仪器厂；JY-92IIN型超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司；PD-1C-50型真空冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司；ATX224型分析天平日本岛津仪器公司；RE-5205型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂。
[0030] 1.2生姜多糖提取步骤
[0031]取干燥的生姜粉，过60目筛，加入20倍质量蒸馏水，超声功率400W，超声时间35min，置于冰浴中提取；
[0032]将提取液进行离心、过滤、旋蒸浓缩、sevag法除蛋白、醇沉，然后对醇沉物进行无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤(2次)后，用蒸馏水复溶后进行真空冷冻干燥，得生姜粗多糖；[0033] 1.3生姜多糖纯化步骤
[0034](1)DEAE-52纤维素阴离子交换层析柱的上样与洗脱
[0035]将生姜多糖用过膜水配制成10mg/mL的样品溶液，过0.45μm的微孔滤膜，上样20mL。分别用0、0.1、0.3、0.5及0.7mol/L氯化钠溶液(用过膜水配制)作为洗脱液进行洗脱，流速为1mL/min，每个浓度的氯化钠溶液收集20管，每管收集10min。将各管收集液在490nm
处进行硫酸-苯酚法逐管测定各管收集液中的多糖含量，并在280nm处测定蛋白含量，以管号作为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制生姜多糖的DEAE-52纤维素阴离子交换层析柱洗脱曲线(图1)。根据洗脱曲线，对多糖含量和蛋白含量之差最大的组分UICP1进行收集，利用旋转蒸发仪于55℃下进行蒸发浓缩，之后用截留分子量为10000Da的透析袋在4℃条件下进行透析除杂48h，冷冻干燥，用于后续实验。
[0036](2)Sephadex G-200葡聚糖凝胶层析柱的上样与洗脱
[0037]将蒸馏水过0.45μm微孔滤膜，制备成过膜水，将经DEAE-52纤维素阴离子交换层析柱分离纯化得到的样品用过膜水配制成10mg/mL的样品溶液，过0.45μm的微孔滤膜，上样2mL。用过膜水配制不同
浓度的NaCl溶液作为洗脱液进行洗脱，流速为0.5mL/min，收集100管，每管收集10min。后续实验操作参照2(1)中DEAE-52纤维素阴离子交换层析柱的实验方法，绘制生姜多糖的Sephadex G-200葡聚糖凝胶层析柱洗脱曲线(图2)，选择多糖含量与蛋白含量之差最大部分进行收集，得一种具有较强抗肿瘤活性多糖UIP1。
[0038]实施例2UIP1对HCT116人结肠癌细胞抑制生长作用
[0039] 1.实验方法
[0040] 1.1细胞复苏
[0041]将保存于液氮罐中的细胞取出，迅速放入37℃恒温水浴锅中，细胞溶解过程中需不停的摇晃细胞液，待细胞液完全解冻后，迅速将细胞液转移至事先加有6mL培养基的离心管中，用移液吹打均匀，放入离心机中，1500rpm，5min，弃上清，加入2mL完全培养基重悬细胞，并将细胞液转移至事先加有7mL完全培养基的培养皿中，做好标记，放入培养箱中培养。
[0042] 1.2细胞传代
[0043]从培养箱中取出需要传代的细胞，用移液吸去培养基，加入2mLPBS，轻轻摇晃，快速用移液吸去PBS，加入1mL胰酶，放入培养箱中进行消化2-3min，待细胞变圆时加入2mL培养基终止消化，
并用移液将细胞吹打下来，转移至10mL离心管中，1500rpm，5min，弃上清，加入2mL培养基将细胞重悬，吸取500μL细胞悬液于事先加有7mL完全培养基的培养皿中，做好标记，放入培养箱中培养。
[0044] 1.3 MTT实验
[0045]从培养箱中取出生长对数期的细胞，用移液吸去培养基，加入2mLPBS，轻轻摇晃，快速用移液吸去PBS，加入1mL胰酶，放入培养箱中进行消化2-3min，待细胞变圆时加入2mL培养基终止消化，并用移液将细胞吹打下来，转移至10mL离心管中，1500rpm，5min，弃上清，加入2mL完全培养基重悬细胞，取10μL细胞悬液于血球计数板，放至光学显微镜下迅速计数，稀释细胞悬液至8x104-1x105个/mL，在96孔板外围一周加上100μL的PBS，设计10个实验组，其中2个为对照组，分别为空白对照组和加DOX试剂的阳性对照组，将细胞液充分混匀，每孔加入100μL细胞悬液，每组实验4个复孔，铺好细胞后放入培养箱培养过夜，待细胞贴壁生长，加入不同浓度的各多糖样品溶液100μL，另注意加入以后的药物浓度应与最初设定相同，对照组加等体积的药物溶剂或培养基，将加药后的96孔板放入培养箱培养48h 后，每孔加20μL MTT，在放入培养箱中4h，将96孔板取出放入孔板离心机中，1500rpm，5min，用注射器吸净上清，在每个细胞孔中加150μL DMSO并放入摇床中避光振荡15min，混合均匀，最后置于酶标仪490nm波长测每孔的吸光度，重复3次实验。
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