具有过氧化物酶活性的多肽

1.本发明涉及具有过氧化物酶活性的多肽。

背景技术

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：：2.辣根过氧化物酶(hrp)是一种工业上重要的酶，具有广泛的应用，包括免疫分析、诊断试剂盒、基于探针的分析技术，如elisa、emsa、蛋白质印迹法和southern印迹杂交、废水处理，作为有机合成的试剂，以及潜在的应用。3.迄今为止，hrp主要是从辣根(armoraciarusticana)毛状根培养物中提取出来的。然而，这种方法低效且耗时。缺点包括产量低、培养时间长、仅季节性供应、同工酶成分异质(制剂的生化特性不同)、根系生长对条件的依赖性以及植物糖基化模式，这些模式对人类具有免疫原性，可能导致不适用于医疗用途。4.重组制备hrp可以确保稳定供应高质量的hrp制剂，是一种更有前景的制备方法，因此，重组制备hrp是毛状根培养的理想替代方法。特别是，在大肠杆菌(e.coli)中进行重组制备可以获得一种具有稳定生化特性但缺乏糖基化并因此不具有免疫原性的亚型的特定制剂。5.然而，基于天然植物的hrp含有八种天冬酰胺残基的糖基化，使得重组制备具有挑战性。与植物源酶相比，大肠杆菌产生的野生型hrp的稳定性极低。6.为了在不同宿主中重组制备hrp，人们做了许多尝试：哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母菌(巴氏酵母菌(p.pastoris)和酿酒酵母(s.cerevisiae))、其他植物(烟草(nicotianatabacum)、本生烟草(nicotianabenthamiana)、辣根(armoracialapathifolia))和大肠杆菌。然而，这些制备方法导致产量极低和/或酶活性和稳定性降低。对于在大肠杆菌的制备，这种情况是由于在大肠杆菌细胞质中的还原条件下，细胞内产生的蛋白质导致包涵体的形成。因此，下游方法比酵母等更精细。所述酶也可以通过添加一个信号序列易位到周质，但随后产量甚至更低，酶的活性可能会因添加易位标记而受到影响。此外，大肠杆菌不能进行翻译后修饰，因此所述酶未糖基化，这导致蛋白质稳定性降低。7.过去进行了几项研究，目的是改善重组hrp的性质。humer和spadiut对此类尝试进行了总结(“improvingtheperformanceofhorseradishperoxidasebysite-directedmutagenesis.”internationaljournalofmolecularsciences20.4(2019):916)，其中公开了一些突变对稳定性和/或酶活性的影响。8.然而，尽管人们已经做了这些研究，仍然缺乏新的和改进的hrp变体。特别是，需要能够在合适的宿主(尤其是大肠杆菌)中重组制备的hrp突变体，并且具有更好的稳定性和/或酶活性。本发明的目的是提供这种hrp突变体。技术实现要素：9.因此，本发明提供了一种具有过氧化物酶活性的多肽，所述多肽包含与seqidno:3具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与seqidno:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中，所述至少一个氨基酸取代是seqidno:1的氨基酸p146或氨基酸n275的取代。10.本发明还提供了一种包含编码本发明所述多肽序列的核酸分子；包含本发明所述的核酸分子的表达载体；以及包含本发明所述的表达载体的宿主细胞。11.本发明还涉及本发明所述多肽的制备方法，包括培养本发明所述宿主细胞和回收所述多肽的步骤。12.在另一方面，本发明提供包含本发明所述多肽的组合物。在另一方面，本发明提供了一种包含所述多肽的试剂盒或本发明所述试剂盒。13.在本发明的上下文中，令人惊讶的是，通过在野生型hrp的脯氨酸-146(p146)和/或天冬酰胺-275(n275)位置引入突变可以改善hrp的性质。特别是，发现在大肠杆菌中可以以高产量和高纯度重组产生此类hrp突变体，显示出较好的热稳定性(参见实施例2)和酶活性(参见实施示例3)。尽管已经对hrp的许多突变进行了研究(见humer和spadiut，“improvingtheperformanceofhorseradishperoxidasebysite-directedmutagenesis.”internationaljournalofmolecularsciences20.4(2019):916)，但现有技术中尚未描述氨基酸p146和/或n275的取代。在uniprot登录号：r0fp47中公开了一种荠菜(capsellarubella)过氧化物酶。ncbi登录号：xp_010503561中公开了一种预测的来自亚麻荠(camelinasativa)的过氧化物酶类蛋白。14.本领域已知野生型hrp的序列，例如来自gajhede等人(“crystalstructureofhorseradishperoxidasecatresolution.”naturestructuralbiology4.12(1997):1032-1038,proteindatabankpdbid1atj)或uniprot登录号：p00433。除非另有说明，本文所用的残基编号是指seqidno:1中列出的野生型hrp序列(p146和n275位置用粗体表示)。15.野生型hrp(seqidno:1)：[0016][0017][0018]植物源酶经过翻译后修饰，除其他外，在没有添加甲硫氨酸的情况下产生一个自由n-末端。然而，当重组制备时，例如在大肠杆菌中，其通常是由起始密码子产生的n-末端甲硫氨酸残基产生。因此，重组制备的野生型hrp通常具有以下序列：[0019]重组制备的野生型hrp(seqidno:2)：[0020][0021]优选地，本发明所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seqidno:1相比包含至少两个氨基酸取代，其中所述至少两个氨基酸取代是seqidno:1的氨基酸p146和n275的取代。从实施例2提供的实验结果可以看出，p146和n275的氨基酸取代组合(在hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k中)可能导致比仅一个位置的取代(hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d或hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d/n275k)具有出乎意料的更高的热稳定性。[0022]在本发明的上下文中，特别优选所述氨基酸序列与seqidno:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述至少一个氨基酸取代选自p146q、p146a、p146r、p146v、p146e、n275k、n275r、n275d、n275s、n275q、n275a和n275e。更优选为p146q或n275k。[0023]在本发明所有实施方案中，优选地，本发明所述多肽的氨基酸序列与seqidno:1相比包含选自p146q、p146a、p146r、p146v和p146e(优选为p146q)的氨基酸取代。更优选地，氨基酸序列与seqidno:1相比包含选自n275k、n275r、n275d、n275s、n275q、n275a和n275e的氨基酸取代，更优选为n275k。最优选为p146(尤其是p146q)的氨基酸取代和n275(尤其是n275k)氨基酸取代组合。从实施例2和3的实验结果可以看出，这样的组合会使得两者都具有较高的热稳定性(在hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275中，与hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d或hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d/n275k相比)和高酶活性(在hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275中，与hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d相比)。[0024]在本发明的上下文中，当所述多肽包含seqidno:3中所述的氨基酸序列时，我们观察到了特别有利的结果。所述序列包括氨基酸取代p146q和n275k，以及相对于seqidno:1的氨基酸取代n13d、n57s、n175s、n255d和n268d(均在下面用粗体标记)。[0025]hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:3)：[0026][0027]如上所述野生型hrp，例如在大肠杆菌中重组制备时，所述突变型hrp通常会产生起始密码子产生的n-末端甲硫氨酸残基。因此，上述hrp突变体通常将以以下序列重组产生蛋白质：[0028]重组制备的hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:4)：[0029][0030]如上所述，本发明所述突变体通常包含n-末端甲硫氨酸。然而，在本发明的一些实施方案中，所述突变体不包含所述n-末端甲硫氨酸。在所有情况下，本发明所述氨基酸编号根据缺少n-末端甲硫氨酸的野生型序列(seqidno:1)进行应用；即所述编号相应地适用于包含n-末端甲硫氨酸的突变体，这意味着，例如在seqidno:4中，突变n13d位于(绝对的)第14号位等。这也适用于携带缺失或插入的其他突变实施方案。[0031]在优选实施方案中，所述多肽包含与seqidno:3具有至少75％，，优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％、最优选至少99％同一性的氨基酸序列。为了增加优选性，所述氨基酸序列与seqidno:3具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％同一性。优选的，所述氨基酸序列为seqidno:3。特别优选的是，本发明所述多肽由seqidno:3氨基酸序列组成。进一步优选的，本发明所述多肽包含seqidno:4氨基酸序列，优选在例如大肠杆菌中重组产生所述多肽。[0032]进一步优选的，所述氨基酸序列与seqidno:1相比，进一步包含至少一个、优选至少两个、更优选至少三个、更优选至少四个、更优选五个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自n13d、n57s、n175s、n255d和n268d。[0033]突变n13d、n57s、n255d和n268d已在capone等人(“glyco-variantlibraryoftheversatileenzymehorseradishperoxidase.”glycobiology24.9(2014):852-863)以及humer和spadiut(“improvingtheperformanceofhorseradishperoxidasebysite-directedmutagenesis.”internationaljournalofmolecularsciences20.4(2019):916)中公开。与此无关，且仅在酵母中表达的情况下，突变n175s已在morawski等人(“functionalexpressionandstabilizationofhorseradishperoxidasebydirectedevolutioninsaccharomycescerevisiae.”biotechnologyandbioengineering76.2(2001):99-107)中公开。[0034]在本发明的上下文中，优选包括与seqidno:1有关的所有上述突变n13d、n57s、p146q、n175s、n255d、n268d和/或n275k。n13d、n57s、n175s、n255d和n268d的五种突变组合导致了高度热稳定性(参见实施例2)。此外，突变p146q和n275k的进一步组合导致酶活性显著增强(参见实施例3；seqidno:4)。[0035]本领域已知天然hrp的其他几种突变，在本发明的上下文中也是优选的。例如，ryan等人(“effectsofsinglemutationsonthestabilityofhorseradishperoxidasetohydrogenperoxide.”biochimie89.8(2007):1029-1032)描述了突变k232n和t110v的有益影响。因此，在优选实施方案中，所述氨基酸序列与seqidno:1相比进一步包含氨基酸取代t110v或k232n。[0036]在本发明的上下文中，“过氧化物酶活性”优选指底物3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(tmb)，2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(abts)或过氧化氢(h2o2)中的至少一种的活性。优选地，在ph5和30℃下，在含有1mmh2o2的50mm柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中进行测定，所述多肽对底物tmb的过氧化物酶活性kcat/km值为至少0.01mm-1s-1，优选为至少0.1mm-1s-1，更优选为至少1mm-1s-1，更优选为至少10mm-1s-1，更优选为至少20mm-1s-1，更优选为至少100mm-1s-1，更优选为至少1000mm-1s-1，更优选为至少10000mm-1s-1，更优选为至少20000mm-1s-1。在另一优选实施方案中，在ph5和30℃下，在含有1mmh2o2的50mm柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中进行测定，所述多肽对底物abts的过氧化物酶活性kcat/km值为至少0.1mm-1s-1，优选为至少1mm-1s-1，更优选为至少10mm-1s-1，更优选为至少100mm-1s-1，最优选为至少250mm-1s-1。在又一优选实施方案中，在ph5和30℃下，在含有10mmabts的50mm柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中进行测定，所述多肽对底物h2o2的过氧化物酶活性kcat/km值为至少1mm-1s-1，优选为至少10mm-1s-1，更优选为至少100mm-1s-1，更优选为至少1000mm-1s-1，最优选为至少2500mm-1s-1。优选地，如实施例1所述方法测定过氧化物酶活性。向50ml去离子水中添加25.7ml0.2m二磷酸二氢钠和24.3ml0.1m柠檬酸可获得50mm柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液。[0037]在相同条件下制备和测定多肽时，本发明所述多肽的过氧化物酶活性优选为野生型hrp(特别是由seqidno:1或seqidno:2、优选seqidno:2所示的氨基酸酸序列组成的多肽)过氧化物酶活性的至少10％、优选至少20％、更优选至少50％。[0038]在优选实施方案中，本发明所述多肽相对于野生型hrp具有更强的热稳定性。对于本发明所述包含与seqidno:3具有一定百分比同一性氨基酸序列的新多肽，优选地，由所述氨基酸序列组成的多肽相对于由seqidno:1或seqidno:2、优选seqidno:2所示的氨基酸序列组成的多肽具有更高的热稳定性。甲硫氨酸残基可以附加到与seqidno:3具有一定百分比同一性的所述氨基酸序列的n-末端，从而可以在大肠杆菌中重组产生；即优选地，相对于由seqidno:2中所示的氨基酸序列组成的多肽，由n-末端甲硫氨酸残基之后的所述氨基酸组成的多肽具有更高的热稳定性。为了比较这两种多肽的热稳定性，在相同的条件下制备和测定多肽。优选地，“更高的热稳定性”意味着在60℃下，在由20mmbistris/hclph7、7％甘油和500mmnacl组成的缓冲液中培养时半衰期更长。优选地，由所述氨基酸序列组成的多肽(和/或本发明所述包含所述氨基酸序列的多肽)的半衰期相对于由seqidno:1或seqidno:2、优选seqidno:2所示的氨基酸序列组成的多肽高至少1.5倍、优选至少3倍、更优选至少6倍、，更优选至少高12倍。优选地，所述半衰期是通过在不同时间点在ph5和30℃下，用溶于含有1mmh2o2的50mm柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液的7mmabts测定剩余过氧化物酶活性来确定的。对于半衰期的测定，所述多肽的浓度优选为2.86μm。优选的，用如实施例1所述方法确定半衰期。[0039]在优选实施方案中，通过在ph5和30℃下，在含有1mmh2o2的50mm柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中用7mmabts测定剩余过氧化物酶活性，由所述氨基酸序列组成的多肽和/或本发明所述包含所述氨基序列的多肽在由20mmbistris/hclph7、7％甘油和500mmnacl组成的缓冲液中在60℃下的半衰期为至少0.5小时、优选至少1小时、更优选至少2小时、更优选至少4小时、最优选至少6小时。[0040]在许多应用中，用hrp与其他分子的结合。这种结合物在诸如蛋白免疫印迹、elisa和免疫组织化学等技术中很有用。与抗体或另一结合蛋白的结合物是一种广泛使用的结合物。在这种情况下，通过添加hrp底物，可以在结合蛋白与其靶标结合的部位产生可检测的信号。其他常用的hrp结合物包括hrp链霉亲和素结合物(例如用于检测生物素化抗体的夹心elisa应用)或hrp蛋白a、g或l结合物(蛋白质a、g和l与免疫球蛋白结合，因此可用于检测初级抗体，例如在elisa、elispot、ihc或蛋白免疫印迹中)。[0041]因此，在优选实施方案中，本发明所述多肽进一步包含链霉亲和素的氨基酸序列。在又一优选实施方案中，所述多肽还包含蛋白质a、蛋白质g或蛋白质l的氨基酸序列。[0042]进一步优选的是，本发明所述多肽包含结合蛋白的氨基酸序列。因此，本发明所述多肽可以是或包含突变hrp和结合蛋白的结合物。所述结合蛋白可以是试剂与所需分子结合的任何蛋白质，例如检测特定蛋白质或其他分子。优选地，所述结合蛋白是抗体。在另一优选实施方案中，所述结合蛋白是抗体片段，优选单链可变片段(scfv)或抗原结合片段(fab)。在另一优选实施方案中，所述结合蛋白是抗体模拟物，优选选自adnectin、亲合体(affinbody)、抗运载蛋白(anticalin)、设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)、kunitz型蛋白酶抑制剂和抗体类似物(monobody)。本领域已知许多此类合适的结合蛋白，例如gebauer和skerra(“engineeredproteinscaffoldsasnext-generationantibodytherapeutics.”currentopinioninchemicalbiology13.3(2009):245-255)。[0043]通过已知方法将hrp连接到结合蛋白可获得hrp与结合蛋白的结合物，例如，通过生成遗传融合(将编码hrp的核酸序列连接到编码结合蛋白的核酸序列，两个蛋白质之间优选包含连接序列)并在合适的宿主(例如大肠杆菌)中表达所得融合蛋白。或者，可以通过化学交联获得这种结合物。为此，hrp(优选纯化)和结合蛋白可以通过化学交联剂连接在一起，在两个分子之间形成稳定的、优选共价的连接。此类方法通常称为生物结合，在本领域是已知的。例如，可以在hermanson，gregt.(hermanson,gregt.bioconjugatetechniques.academicpress,2013年)一书中到大量合适的方法。下文还描述了适用于本发明试剂盒的交联剂。[0044]hrp与其他蛋白质(如链霉亲和素或蛋白质a、g或l)之间的结合物可通过与结合蛋白结合物类似的方法获得。[0045]优选的，本发明所述多肽可以通过培养包含合适表达载体的宿主细胞重组来制备。所述宿主细胞优选为酵母(酵母菌，毕赤酵母)细胞或原核细胞。优选的，所述宿主细胞是细菌，最优选是大肠杆菌。[0046]优选的，所述多肽是一种分离的多肽。所述多肽可从细胞培养物中分离出来，并可根据具体应用进行纯化和/或浓缩。[0047]可以使用本领域已知的标准方法制备本发明所述多肽。例如，humer和spadiut(“improvingtheperformanceofhorseradishperoxidasebysite-directedmutagenesis.”internationaljournalofmolecularsciences20.4(2019):916)。smith等人(“expressionofasyntheticgeneforhorseradishperoxidasecinescherichiacoliandfoldingandactivationoftherecombinantenzymewithca2+andheme.”journalofbiologicalchemistry265.22(1990):13335-13343)或gundinger和spadiut(“acomparativeapproachtorecombinantlyproducetheplantenzymehorseradishperoxidaseinescherichiacoli.”journalofbiotechnology248(2017):15-24)。优选的，如实施例1所述方法制备本发明的多肽。[0048]关于本发明所述组合物，优选的，所述组合物包含一种或多种赋形剂。例如，所述赋形剂可以进一步提高本发明多肽储存时的稳定性，确保更长的保质期和稳定的生物活性水平。优选的，所述赋形剂包括ph缓冲剂、稳定剂、填充剂、张度调节剂(tonicitymodifiers)等。特别优选适用于冷冻干燥的赋形剂。[0049]本领域技术人员已知合适的赋形剂。例如，所述组合物优选含有ph缓冲剂，优选选自甘氨酸、组氨酸、谷氨酸、琥珀酸、磷酸盐、乙酸盐和天冬氨酸。所述组合物进一步优选包括填充剂，所述填充剂优选选自甘露醇、甘氨酸、蔗糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、乳糖、山梨醇、海藻糖或木糖醇。所述组合物优选包括稳定剂，所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纤维二糖、龙胆糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇、甘氨酸、盐酸精氨酸、多羟基化合物(包括多糖，例如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、环糊精、n-甲基吡咯烷、纤维素和透明质酸)、氯化钠。所述组合物还可包括表面活性剂，优选选自十二烷基硫酸钠、琥珀酸二辛酯钠、磺酸钠二辛酯、鹅去氧胆酸、n-十二烷基肌氨酸钠、十二烷基硫酸锂、1-辛烷磺酸钠、水合胆酸钠、脱氧胆酸钠、甘氨脱氧胆酸钠、苯扎氯铵或氯苄乙铵、十六烷基氯化吡啶、十六烷基三甲基溴化铵、chaps、chapso、sb3-10、sb3-12、洋地黄皂苷、tritonx-100、tritonx-114、聚桂醇400、硬脂酸聚烃氧40酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、40、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯20、40、60、65和80、大豆卵磷脂、dopc、dmpg、dmpc和dopg；蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。[0050]有利地，所述组合物包含至少0.01mg的所述多肽，优选至少0.1mg、更优选至少1mg、更优选至少5mg、更优选至少10mg。所述组合物含有浓度至少为0.0001％(重量/重量，w/w)的所述多肽，优选至少0.001％w/w、更优选至少0.01％w/w，更优选至少0.1％w/w，更优选至少1％w/w，更优选至少10％w/w。[0051]有利地，所述组合物是固体组合物(在25℃和大气压下)，优选冻干组合物。在另一优选实施方案中，所述组合物是液体组合物(在25℃和大气压下)。优选的，所述组合物含有浓度为至少0.001mg/ml的所述多肽，优选至少0.01mg/ml，更优选至少0.1mg/ml，更优选至少0.5mg/ml，最优选至少2mg/ml。[0052]进一步优选的是，本发明所述组合物中包含的本发明所述多肽是从宿主分离，例如从大肠杆菌等细菌分离。具体而言，优选本发明所述组合物基本上不含dna，尤其是dsdna。优选的，所述组合物含有小于1μg/g的dna，优选小于100ng/g，更优选小于10ng/g，最优选小于1ng/g。所述dna的浓度通过染料sybrgreeni(n',n'-二甲基-n-[4-[(e)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1-铀-2-基]-n-丙基丙烷-1,3-二胺)进行荧光法测定。使用本领域技术人员熟悉的荧光法测定。所述测定可以按照rengarajan，kalpana等人的描述进行(“technicalbriefquantifyingdnaconcentrationsusingfluorometry:acomparisonoffluorophores.”molecularvision8(2002):416-421)。[0053]本发明所述多肽可用于多种应用，例如在靶向癌症中。因此，在优选实施方案中，所述组合物是药物组合物，优选包含一种或多种赋形剂，所述赋形剂施用于个体(尤其是哺乳动物，尤其是人类)时在药学上是可接受的。优选的赋形剂为本领域技术人员已知，例如水(优选为注射用水)、生理盐水、林格溶液、葡萄糖溶液、缓冲液、汉克溶液、囊泡形成化合物(例如脂质)、固定油、油酸乙酯、5％葡萄糖生理盐水、增强等渗性和化学稳定性的物质、缓冲液和防腐剂。其他合适的赋形剂包括任何当给患者服用不会诱导抗体产生对患者有害时的化合物。示例为耐受性良好的蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。所述药物组合物优选适用于肠外给药，尤其是静脉给药。所述药物组合物可以以注射剂量单位形式施用，例如作为溶液、悬浮剂或乳剂，与上述药学上可接受的赋形剂一起配制。当所述组合物为药物组合物时，上述针对本发明组合物的所有优选实施方案(尤其与多肽的浓度和量有关)也是优选的。[0054]在应用中，本发明所述多肽可以是酶前药体系的一部分。本领域已知包含hrp的酶前药体系，尤其是用于癌症的酶前药体系(参见例如tupper等人。“invivocharacterizationofhorseradishperoxidasewithindole-3-aceticacidand5-bromoindole-3-aceticacidforgenetherapyofcancer.”cancergenetherapy17.6(2010):420-428)。例如，靶向癌症可能涉及包含hrp和吲哚乙酸(iaa)的酶前药体系，其中hrp氧化吲哚乙酸(iaa)，从而降低癌细胞活力。单独使用前药iaa和hrp都没有细胞毒性，这表明将这两种物质以一种纯净的、对人类可调和的、非免疫原性的形式结合起来以获得所需的细胞毒性效果是有必要的。在另一项研究中，hrp可以将扑热息痛转化为强大的细胞毒素(tupper等人，“useofhorseradishperoxidaseforgene-directedenzymeprodrugtherapywithparacetamol.”britishjournalofcancer90.9(2004):1858-1862)。然而，市面上可买到的植物hrp制剂在所述转化反应中效果较差，因此没有进一步开展这项研究。本发明所述多肽尤其可用于抗体导向酶前药(adept；例如，参见bagshawe“antibody-directedenzymeprodrugtherapy(adept)forcancer”expertreviewofanticancertherapy6.10(2006):1421-1431)。adept的原理通常是使用针对肿瘤相关抗原的抗体将酶(例如hrp)定位到肿瘤部位。可以给患者服用前药，然后将前药在特定位置给予患者，前药之后转化为激活状态。[0055]本发明所述核酸分子也可用于，特别是用于基因，例如基因导向酶前药疗法(gdept)或adept。[0056]对于许多应用，特别诸如废水处理(例如去除氯酚)的工业应用，将本发明所述多肽固定在固体载体上是特别有利的。因此，优选的，本发明组合物包含的多肽固定在固体载体上。除其他优点外，酶固定化可实现特别高的存储稳定性、增强的重复使用性、降低操作过程成本等。固定在固体载体上的hrp及其工业应用在本领域是已知的，例如，见tatsumi等人(“removalofchlorophenolsfromwastewaterbyimmobilizedhorseradishperoxidase.”biotechnologyandbioengineering51.1(1996):126-130)和sarno和iuliano(“immobilizationofhorseradishperoxidaseonfe3o4/au_gonanoparticlestoremove4-chlorophenolsfromwastewater.”chemicalengineeringtransactions73(2019):217-222)。在固体载体上固定酶的方法是本领域技术人员已知的，如andreescu等人所述(“chapter7-nanostructuredmaterialsforenzymeimmobilizationandbiosensors.”thenewfrontiersoforganicandcompositenanotechnology.elsevier,2008,355-394)。[0057]纳米材料的比表面积和有效的酶负载特别适合作为固体载体。因此，在本实施方peg/citrateaqueoustwo-phasesystem.”thejournalofphysicalchemistryb118.9(2014):2506-2517)。[0065]本发明所述多肽可进一步用作聚合物交联反应物。例如，hrp已用于制备水凝胶的右旋糖酐-酪胺结合物的酶交联，例如用作软骨组织工程应用的3d支架。(jin等人，“enzymaticallycrosslinkeddextran-tyraminehydrogelsasinjectablescaffoldsforcartilagetissueengineering.”tissueengineeringparta16.8(2010):2429-2440)。[0066]为了便于理解本发明，以下定义了一些术语。本文定义的术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义。诸如“一个”、“一种”和“所述”等术语并非仅指单一实体，而是包括可用于举例说明的一般类别。除非权利要求中记载，本文中的术语用于描述本发明的具体实施方案，但其用法并不对本发明具有限定作用。[0067]参考多肽或蛋白质序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”、“x％序列同一性”或“x％相同”(例如“70％序列同一性”或“70％同一性”)定义为候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，在比对序列并引入空位后，如有必要，以实现最大序列同一性百分比，并且不将任何保守替换视为序列同一性的一部分。确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用诸如blast、blast-2、align、align-2、megalign(dnastar)或emboss软件等公众可得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测定比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，在本发明中，emboss软件包的计算机程序“needle”的序列比对计算％氨基酸序列同一性(可从欧洲分子生物学实验室公开获得；rice等人，emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite,trendsgenet.2000jun；16(6):276-7,pmid:10827456)。[0068]可以在网站上访问needle程序http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/或下载用于本地安装，作为emboss包的一部分，从http://emboss.sourceforge/。其在许多广泛使用的unix操作系统上运行，如linux。[0069]为了比对两个蛋白质序列，最好使用以下参数运行needle程序：[0070]commandline：needle-auto-stdout-asequencesequence_file_a-bsequencesequence_file_b-datafileeblosum62-gapopen10.0-gapextend0.5-endopen10.0-endextend0.5-aformat3pair-sprotein1-sprotein2(align_format:pairreport_file:stdout)[0071]给定氨基酸序列a与给定氨基酸序列b的氨基酸序列同一性百分比(也可表示为给定氨基酸序列a具有或包含给定氨基酸序列b相同或反向氨基酸序列同一性百分比)计算如下：[0072]分数x/y的100倍，[0073]其中x是序列比对程序needle中a和b比对完全一致的氨基酸残基数，y是b中氨基酸残基的总数。可以理解，其中氨基酸序列a的长度与氨基酸序列b的长度不同时，a到b的氨基酸序列同一性百分比不等于b到a的氨基酸序列同一性百分比。如果a的序列与b的整个序列同一性超过n％，y是b的整个顺序长度(即b中氨基酸残基的总数)。除非另有特别说明，否则本文中使用的所有氨基酸序列同一性百分比都是按照前一段中的描述使用计算机程序needle获得的。[0074]除非另有规定，否则本文使用的所有参数均为iupacsatp条件下的参数(“标准环境温度和压力”)，优选是温度25℃和压力101.300pa。[0075]此处使用的百分比(％)对应于每体积重量(w/v)，除非指定为重量/重量(w/w)或其他。[0076]本发明涉及以下优选实施方案：[0077]实施方案1，一种具有过氧化物酶活性的多肽，所述多肽包含与seqidno:3具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与seqidno:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述至少一个氨基酸取代为seqidno:1的氨基酸p146或氨基酸n275的取代。[0078]实施方案2，一种具有过氧化物酶活性的多肽，所述多肽包含与seqidno:3具有至少70％序列同源性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与seqidno:1相比包含至少两个氨基酸取代，其中所述至少两个氨基酸取代为seqidno:1的氨基酸p146和氨基酸n275的取代。[0079]实施方案3，一种具有过氧化物酶活性的多肽，所述多肽包含与seqidno:3具有至少70％序列同源性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与seqidno:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述至少一个氨基酸取代选自p146q、p146a、p146r、p146v、p146e、n275k、n275r、n275d、n275s、n275q、n275a和n275e；优选为p146q或n275k。[0080]实施方案4，根据实施方案1至3中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列与seqidno:1相比包含选自p146q、p146a、p146r、p146v和p146e氨基酸取代，优选p146q。[0081]实施方案5，根据实施方案1至4中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列与seqidno:1相比包含选自n275k、n275r、n275d、n275s、n275q、n275a和n275e氨基酸取代，优选为n275k。[0082]实施方案6，根据实施方案1至5中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列与seqidno:1相比包含氨基酸取代p146q和n275k。[0083]实施方案7，一种具有过氧化物酶活性的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与seqidno:3具有至少70％序列同一性，其中所述氨基酸序列包含至少[0084]-与seqidno:1相比，一个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自p146q、p146a、p146r、p146v和p146e，优选p146q；和[0085]-进一步的，与seqidno:1相比，氨基酸取代选自n275k、n275r、n275d、n275s、n275q、n275a和n275e，优选n275k。[0086]实施方案8，根据实施方案1至7中任一项的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与seqidno:3具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％、更优选至少99％的序列同一性；最优选地，其中所述多肽的氨基酸序列为seqidno:3中所述的序列。[0087]实施方案9，根据实施方案1至8中任一项的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列为seqidno:4中所述的序列。[0088]实施方案10，根据实施方案1至9中任一项的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与seqidno:1相比包含至少一个、优选至少两个、更优选至少三个、更优选至少四个、更优选no:1或seqidno:2中所述氨基酸序列组成的多肽至少高1.5倍、优选至少3倍、更优选至少6倍、甚至更优选至少12倍。[0102]实施方案24，根据实施方案1至23中任一项的多肽，其中所述多肽还包括结合蛋白的氨基酸序列，优选抗体的氨基酸序列。[0103]实施方案25，根据实施方案1至24中任一项的多肽，其中所述多肽还包括链霉亲和素的氨基酸序列。[0104]实施方案26，根据实施方案1至25中任一项的多肽，其中所述多肽还包括蛋白质a、蛋白质g或蛋白质l的氨基酸序列。[0105]实施方案27，一种核酸分子，包含根据实施方案1至26中任一项多肽的编码序列。[0106]实施方案28，包含根据实施方案27的核酸分子的表达载体。[0107]实施方案29，包含根据实施方案28的表达载体的宿主细胞。[0108]实施方案30，根据实施方案29的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌，优选大肠杆菌。[0109]实施方案31，一种根据实施方案1至26中任一项多肽的制备方法，包括培养根据实施方案30所述宿主细胞和回收所述多肽的步骤。[0110]实施方案32，一种包含根据实施方案1至26中任一项的多肽的组合物。[0111]实施方案33，根据实施方案32的组合物，其进一步包含一种或多种赋形剂。[0112]实施方案34，根据实施方案32或33的组合物，其中所述组合物包含至少0.01mg的所述多肽，优选至少0.1mg，更优选至少1mg，更优选至少5mg，更优选至少10mg。[0113]实施方案35，根据实施方案32至34中任一项的组合物，其中所述组合物包含浓度至少为0.0001％w/w的所述多肽，优选至少0.001％w/w，更优选至少0.01％w/w，更优选至少0.1％w/w的，但更优选至少1％w/w，尤其更优选至少10％w/w。[0114]实施方案36，根据实施方案32至35中任一项的组合物，其中所述组合物是药物组合物，优选地包括药学上可接受的赋形剂。[0115]实施方案37，根据实施方案32至36中任一项的组合物，其中所述多肽固定在固体载体上，所述固体载体优选纳米颗粒。[0116]实施方案38，一种试剂盒，所述试剂盒包含实施方案1至26中任一种多肽或根据实施方案32至37中任一种的组合物。[0117]实施方案39，根据实施方案38的试剂盒，其中所述多肽为冻干形式。[0118]实施方案40，根据实施方案38或39的试剂盒，其中所述多肽为溶液形式。[0119]实施方案41，根据实施方案38至40中任一项的试剂盒，还包括适于将多肽结合到另一蛋白质的交联剂。[0120]实施方案42，根据实施方案38至41中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒还包括选自缓冲液、试剂和说明书的组分。附图说明[0121]以下附图和实施例进一步说明本发明，但本发明不限于此。[0122]图1与重组野生型hrp(rhrp，seqidno:2)和植物源hrp(phrp)相比，hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(mhrp，seqidno:4)的残余活性。在60℃下，在50mmbistris/hclph7、0.5mnacl、7％甘油中，将150μl浓度为2.86μm的phrp(三角形)、mhrp(方形)和rhrp(圆形)培养10h。如实施例1所述，用abts测定初始酶活性和残余酶活性，并以％为单位绘制培养时间曲线。mhrp的热稳定性比rhrp提高了13倍以上，甚至比植物源(即糖基化)phrp提高1.7倍。具体实施方式[0123]实施例1材料和方法[0124]hrp突变体的表达与纯化[0125]vi-a型植物hrp(分类号：p6782)来自sigma-aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。除非另有规定，否则在大肠杆菌中产生的所有hrp变体都包括包含指示突变的seqidno:2序列。[0126]表达宿主和质粒[0127]如前所述，进行了标准分子克隆技术(humer和spadiut，“improvingtheperformanceofhorseradishperoxidasebysite-directedmutagenesis.”internationaljournalofmolecularsciences20.4(2019):916)。编码hrp变体c1a(野生型hrp；seqidno:2)的hrp基因是针对大肠杆菌优化的密码子，所述hrp基因从genscriptusainc.(美国新泽西州皮斯卡塔韦)获得。hrp由psf-t7-laco-nh2-dsba(og4591)(oxfordgeneticsltd.，牛津，英国)或pet21d+(novagen，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)在大肠杆菌菌株bl21(de3)(lucigen，米德尔顿，威斯康星州，美国)中产生。质粒psft7编码一个dsb标记，以输出到易位后被裂解的周质中。质粒pet21d+用于细胞质中hrp包涵体的产生。引入了一个终止密码子，产生的蛋白质没有任何标记。[0128]包涵体(ib)的蛋白质表达和纯化[0129]sb培养基(32gl-1的胰蛋白胨；20gl-1的酵母提取物；5gl-1nacl；5mmnaoh)用于培养bl21(de3)细胞，所述细胞包含不含任何n-末端标记或c-末端标记的hrp基因(或其变体)的载体pet21d+。加入氨苄青霉素至终浓度为100mgl-1。在37℃下，在50mlsbamp培养基中振荡(250rpm)培养预培养物过夜，并接种至2.5l超高产烧瓶(uyf)，以在最终体积为500ml的sbamp培养基中达到0.3的光密度(od600)。在37℃下振荡(250rpm)培养细胞，直至od600为0.5，加入0.1mm异丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导hrp表达。在25℃和250rpm下培养20h后，通过离心(5000g，20min，4℃)收集细胞。[0130]使用ikat10碱性ultra-turrax在3-5ml缓冲液a/g湿生物量(缓冲液a:50mmtris/hcl；ph8；500mmnacl；1.5mmedta)中重悬生物质，并均质化(使用geanirosoavipandaplus)(》1300bar，3次，冷却)。离心均质悬浮液(15650g；20min，4℃)，丢弃上清液，在10ml缓冲液b(缓冲液b:50mmtris/hcl；ph8；500mmnacl；2m尿素)/g湿细胞碎片中重悬细胞碎片，然后再次离心(15650g；20min，4℃)。使用缓冲液b清洗，重复一次。然后，在水中重悬ib/细胞碎片(5ml水/g湿细胞碎片)，将悬浮液加入预先称重的50ml反应管中，离心分离(15650g；20min，4℃)，并将颗粒储存在-20℃下，备用。[0131]为了溶解，解冻冰冻的ib，称重以计算湿包涵体(wib)的重量，并在适当的溶解缓冲液(50mmtris/hcl；ph8.5；6m尿素)中重悬，以使wib浓度达到100g/l。重悬后，加入dtt(使用1mdtt储备液)，使溶解混合物中dtt的最终浓度达到7.11mm，并培养溶解混合物(4℃；0.5h；轻微搅拌)，然后离心(20379g；20min；4℃)。上清液立即用于复性，丢弃固体颗粒。[0132]在适当的复性缓冲液(例如，20mmtris/hclph8.5，2m尿素，7％甘油，2mmcacl2，1.27mmgssg)中以1:40的比例稀释溶解物，加入终浓度为20μm的氯化血红素，并在10℃下复性19小时。[0133]通过疏水谱(hic)进一步纯化蛋白质。使用装有丁基-琼脂糖凝胶4ff(gehealthcare)的谱柱，柱床体积为80ml。缓冲液a(缓冲液a：20mmbistrisph7；4mnacl)以113cm/h的流速平衡谱柱，直到所有信号保持不变。然后以90cm/h的流速施加1250-1300ml加载。加载后，用20％缓冲液b(缓冲液b:20mmbis-trisph7)以90cm/h的流速清洗2个柱体积(cv)。此后，用75％缓冲液b(流速79cm/h)和100％缓冲液b进行分步洗脱，用75％的缓冲液b洗脱活性hrp。[0134]动力学参数[0135]使用tecaninfinitem200pro仪器(tecan，瑞士)，在96孔板分析中测定底物abts、tmb和过氧化氢的酶动力学参数。[0136]对于以3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)为底物的测定，96孔板每个孔中的反应混合物包含在50mm柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(ph为5)中浓度为1mm的饱和过氧化氢和不同浓度(20-550μm)的tmb，最终体积为200μl。将蛋白质样品(5μl)与175μltmb缓冲液混合物混合，并与20μl过氧化氢溶液(10mm)开始反应。在tecaninfinitem200pro仪器中，在30℃的温度下，在652nm处持续60秒吸收增加。使用sigmaplot软件(systatsoftwareinc.，美国加利福尼亚州圣何塞)计算动力学参数，消光系数ε652＝39mm-1cm-1(见josephy等人，“thehorseradishperoxidase-catalyzedoxidationof3,5,3',5'-tetramethylbenzidine.freeradicalandcharge-transfercomplexintermediates.”journalofbiologicalchemistry257.7(1982):3669-3675)。[0137]对于以abts为底物的测定，96孔板每个孔中的反应混合物包含在50mm柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(ph为5)中浓度为1mm的饱和过氧化氢和不同浓度(0.1-7mm)的abts，最终体积为200μl。将蛋白质样品(5μl)与175μlabts缓冲液混合物混合，并与20μl过氧化氢溶液(10mm)开始反应。在tecaninfinitem200pro仪器中，在30℃的温度下，在420nm处持续120秒吸收增加。使用sigmaplot软件(systatsoftwareinc.，美国加利福尼亚州圣何塞)计算动力学参数，消光系数ε420＝36mm-1cm-1(见childs和bardsley。“thesteady-statekineticsofperoxidasewith2,2′‑azino-di-(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonicacid)aschromogen.”biochemicaljournal145.1(1975):93-103)。[0138]对于以过氧化氢为底物的测定，96孔板每个孔中的反应混合物包含在50mm柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(ph为5)中浓度为10mm的饱和abts和不同浓度(0.001-1mm)的过氧化氢浓度，最终体积为200μl。将蛋白质样品(5μl)与145μl过氧化氢缓冲液混合物混合，并与50μlabts溶液(40mm)开始反应。在tecaninfinitem200pro仪器中，在30℃的温度下，在420nm处持续120秒吸收增加。使用sigmaplot软件(systatsoftwareinc.，美国加利福尼亚州圣何塞)计算动力学参数，消光系数ε420＝36mm-1cm-1(见childs和bardsley。“thesteady-statekineticsofperoxidasewith2,2′‑azino-di-(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonicacid)aschromogen.”biochemicaljournal145.1(1975):93-103)。[0139]热稳定性[0140]在60℃下，在50mmbistris/hclph7、7％甘油和500mmnacl中测定酶变体的热稳定性。在0、30、60、90和120分钟后用abts测定hrp野生型(seqidno:2)和hrpn13d/n57s/n255d/n268d的酶活性；在0、90、180、300、420和588分钟后，测定变体hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d、hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d，hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d/n275k和hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k的酶活性，以及在0、90、180、300和420分钟后，测定植物hrp的酶活性。热处理期间，包括植物hrp在内的所有变体的酶浓度为2.86μm。然后将样品在冰上冷却5分钟，然后在4℃下以16162g离心15分钟。随后，使用tecaninfinitem200pro仪器，使用7mmabts测定残余活性。反应混合物含有5μl蛋白质、在50mm柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(ph为5)中浓度为1mm的饱和过氧化氢和7mm的abts，总体积为200μl。在30℃下，在420nm处持续120s，随后吸收增加。绘制残余酶活性随孵育时间的曲线，并使用以下方程式中的失活速率计算60℃下的半衰期：[0141]t1/2＝ln(2)/kin[0142]其中t1/2是半衰期，kin是对数剩余活度的斜率。[0143]实施例2hrp突变体的热稳定性[0144]如实施例1所述，表达和纯化了hrp的几个突变体，并测定了其热稳定性。发现一些突变提高了热稳定性。最优选的突变型hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:4)的热稳定性比野生型hrp(seqidno:2)提高了13倍以上，甚至比植物衍生(即糖基化)酶的热稳定性提高了1.7倍。重要的是，突变体p146q和n275k(hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k)的组合的热稳定性明显高于单突变体p146q(hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d)或n275k(hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d/n275k)的热稳定性。[0145]表1.植物hrp和重组产生的hrp变体的热稳定性[0146][0147][0148]实施例3hrp突变体的动力学参数[0149]如实施例1所述，表达和纯化了hrp的几个突变体，并测定了底物abts、tmb和过氧化氢的动力学参数。发现hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:4)对底物tmb和双氧水中的活性明显高于hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d。发现突变体p146q和n275k对酶活性有强烈的有益影响。[0150]表2.底物tmb的动力学参数[0151][0152]表3底物h2o2的动力学参数[0153][0154]表4.底物abts的动力学参数[0155][0156]实施例4与植物源hrp和野生型hrp的比较[0157]将hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:4)与野生型hrp(seqidno:2)以及植物源hrp(phrp)的动力学参数和热稳定性进行了比较。如实施例1所述方法测定动力学参数和热稳定性。[0158]热稳定性的测定结果如图1所示。如上文实施例2中所述，最优选的突变体hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(mhrp，seqidno:4)的热稳定性比野生型hrp(rhrp，seqidno:2)提高了13倍以上，甚至比植物源(即糖基化)phrp的热稳定性提高了1.7倍(见表1)。此外，研究发现，即使所述优选的突变体的热稳定性得到了极大的改善，其与野生型hrp(rhrp，seqidno:2)和植物衍生hrp也具有相近的催化效率(见下表5和6)。[0159]表5.底物abts的动力学参数[0160][0161]表6.底物tmb的动力学参数[0162][0163][0164]实施例5.146位和275位的定点饱和突变[0165]为了测试p146和n275位所有可能的氨基酸取代的效果，对这些位点进行了定点饱和突变。作为定点饱和突变的起点，选择了首选突变株hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:3)。分别研究了146位和275位氨基酸取代的影响。[0166]生成文库[0167]以下质粒是用标准分子克隆技术构建的。使用psf-t7中hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:3)的全质粒pcr，通过146位和275位的定点饱和突变，引入hrp基因突变。使用相应的寡核苷酸扩增6.3kb片段，以生成定点饱和文库(表7)。所有寡核苷酸均购自microsynth(balgach，瑞士)。根据以下方案对寡核苷酸进行磷酸化：300pmol引物dna、1×t4pnk缓冲液(neb)、1mmatp、5％peg、10单位t4多核苷酸激酶(pnk，neb)。在37℃培养45分钟反应，然后在65℃热失活20分钟。每个pcr反应包含1×q5反应缓冲液、200μmdntpmix、200nm正向和反向磷酸化引物、100ng模板载体dna和1uq5高保真dna聚合酶。pcr产物用新英格兰生物实验室(neb，美国马塞诸塞州伊普斯威奇)的monarchpcr&dna除杂试剂盒纯化，用fastdigestdpni(thermoscientifictm,美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)分解模板质粒dna。将2个dpni的fdu(fastdigest单元)加入到清洁的pcr产品中，并在37℃下孵育4小时。质粒在80℃下热失活20分钟后，钝端连接：50ng质粒dna，1×t4dna连接酶缓冲液(neb)，400个粘性末端单位t4dna连接酶(neb)，16℃过夜。在65℃下热灭活20分钟后，质粒转化为bl21(de3)。[0168]表7.用于全质粒pcr的引物[0169][0170][0171]筛选[0172]从筛选培养皿上挑取阳性转化子，并在37℃、250rpm的塑料盒中，在96孔板中用200μlsb培养基(32gl-1胰蛋白胨；20gl-1酵母提取物；5gl-1nacl；5mmnaoh；50mgl-1卡那霉素)培养16小时，以防干燥。随后，将90μl75％甘油添加到原始皿中，然后将其储存在-80℃下。将10μl原始皿培养物接种至含有190μlsb培养基的辅助皿。这里，培养基含有2mmcacl2；6μm氯化血红素和0.1mmiptg，最终体积为200μl。在25℃、250rpm的塑料盒中将细胞培养16小时，细胞密度通过使用tecaninfinitem200pro(tecan，瑞士)读板器测定600nm处的吸光度来确定。然后，使用thermofisherlynxsorvall离心机在4℃下以5000g的速度离心6分钟，并将细胞完全悬浮在200μl/孔b-per细菌蛋白提取试剂(thermoscientific，美国马塞诸塞州沃尔瑟姆)、5uml-1dnasei和1/2蛋白酶抑制剂混合物(complete片剂，不含edta；rochediagnosticsgmbh，德国曼海姆)和200mmmgcl2中。在室温下进行15分钟的细胞裂解，在5000g、4℃下离心20分钟。然后用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量。将每个孔的90μl转移到一个新的培养皿中，该培养皿在80℃下培养20分钟(146位)或在80℃下培养15分钟(275位)，然后将加热的培养皿和对照培养皿在5000g、4℃下再次离心20分钟。随后，用395μmtmb(146位)或406μmtmb(276位)测定酶活性，1mmh2o2和10μl细胞裂解液置于50mm柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(ph5)中，总体积为200μl。在30℃下进行测定，并使用tecaninfinitem200pro酶标仪监测652nm处吸光度的增加(蓝tmb自由基的ε＝3.9x104m-1cm-1)120s。使用总蛋白浓度对初始和残余活性进行标准化，以残余活性与初始活性的比率代表热稳定性。每个位置筛选180个菌落，这对应于预期的文库完整性超过99％。每个培养皿含有6个hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k菌落(对应seqidno:3)作为阳性对照。[0173]结果[0174]下面的表8(p146位)和表9(n275位)显示了所选突变体的结果。由于本实施例使用96孔板筛选分析，因此可变性(标准偏差)高于本文报告的其他分析。因此，每个突变体的结果只能在测定的每个培养皿内进行比较。[0175]从表8和表9可以看出，146位和275位的多种不同氨基酸取代具有优异的热稳定性。每个位置的几种氨基酸取代产生了有利的结果。在146、146a、146r、146v、146e位，尤其是146q位的情况下特别有利(均在最优选突变体146q的标准偏差范围内)。在275位的情况下，275r、275d、275s、275q、275a、275e，尤其是275k的最佳(均在最优选突变体275k标准偏差范围内)。[0176]表8.146位定点饱和突变产生的选定突变体。测定了两个单独的培养皿(应在每个培养皿内比较结果)。某些突变体含有相同的氨基酸取代。对于对照组(seqidno:3)，给出了六个重复的平均值和标准偏差。[0177]氨基酸取代u/mg总蛋白质残余活性皿1：ꢀꢀ146q(对照)0.056±0.00849％±14％146a0.05450％146e0.04853％146r0.05260％146r0.05359％146q0.05760％皿2：ꢀꢀ146q(对照)0.058±0.00474％±6％146v0.04975％146q0.05977％146q0.05777％146q0.05682％[0178]表9.275位定点饱和突变产生的选定突变体。测定了两个单独的培养皿(应在每个培养皿内比较结果)。某些突变体含有相同的氨基酸取代。对于对照组(seqidno:3)，给出了六个重复的平均值和标准偏差。[0179][0180][0181]实施例6.优选hrp突变体的动力学参数和热稳定性[0182]根据野生型hrp(seqidno:2)、hrpn175s和hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d，研究p146和n275位突变的效果。此外，还研究了单突变体及其组合的效果。在这种情况下，通过在60℃测定特定酶活性和热稳定性来确定p146和n275位突变对生化特性的作用。[0183]材料和方法[0184]以下野生型hrp突变体(seqidno:2)由sanger测序法创建并验证：hrpp146q、hrpn175s、hrpn275k、hrpp146q/n275k、hrpp146q/n175s、hrpn175s/n275k和hrpp146q/n175s/n275k。如实施例1所述方法进行纯化。也如实施例2所述方法测定动力学参数和热稳定性。[0185]比酶活性(abts)[0186]用tecan酶标仪以abts为底物测定所有hrp变体的单位/mg蛋白质比活性(表10)。hrpp146q的比活性比hrp野生型提高了1.4倍。有趣的是，hrpn175s的比活性较低；而hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:4)的比活性没有降低，并恢复为hrp野生型的比活性值。[0187]表10与hrp野生型和hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k相比，所选hrp变体以abts为底物的比活性[0188][0189][0190]比酶活性(h2o2)[0191]此外，以过氧化氢为底物测定单位/mg蛋白质的比活性。在此，以过氧化氢为底物的比活性趋势与以abts为底物测得的数据相同，其中变体p146q比活性增加，n175s比活性降低。双突变体p146q/n175s和n175s/n275k以及三突变体p146q/n175s/n275k也是如此。当n175s缺失或seqidno:4出现突变时的比活性与seqidno:2相当甚至更好。[0192]表11.与hrp野生型和hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k相比，所选hrp变体以h2o2为底物的比活性[0193]hrp变体比活性[u/mg]hrp野生型(seqidno:2)1151±113hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:4)983±104hrpp146q1522±133hrpn175s734±54hrpn275k1258±90hrpp146q/n275k1027±31hrpp146q/n175s756±25hrpn175s/n275k711±35hrpp146q/n175s/n275k718±28[0194]比酶活性(tmb)[0195]关于底物tmb，hrp变体之间的比活性差异不太明显。然而，p146q的比酶活性再次显著增加，而n175s的u/mg比野生型最低。[0196]表12.与hrp野生型和hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k相比，选定hrp变体以tmb为底物的比活性[0197][0198][0199]热稳定性[0200]本发明研究了在60℃下所有hrp突变体的酶稳定性，令人惊讶的是，n175s并不是高温下稳定性增加的唯一原因。hrpn13d/n57s/n255d/n268d突变使得酶的半衰期增加了1.5倍，而hrpn175s突变使得酶的稳定性提高了7.7倍，两者组合后，酶的稳定性比hrp野生型提高了13倍，表明了两者具有协同效应(表13)。由于hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d和hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:4)显示了相近的稳定性，可以假设这种增强的原因是与n175s组合的四倍突变。[0201]对于p146q和n275k，相对于hrp野生型，单突变体和双突变体p146q/n275k的稳定性略有降低。然而，三重突变体p146q/n175s/n275k与单突变体n175s表现出相同的稳定性，而双突变体p146q/n175s和n175s/n275k则不太稳定。这表明，当只有一个突变体与n175s组合时，对稳定性产生不利影响，这种影响在多种突变的组合中得到缓解，表明p146q、n275k和n175s之间存在协同效应。与n13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:4)相比，hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d和hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d/n275k的效果也相同。[0202]表13几种hrp变体的热稳定性，即60℃下的半衰期。灰阴影数据为实施例2以进行对照[0203][0204][0205]结论[0206]结果发现，p146q取代导致所有受试底物的hrp酶活性强烈增加。例如，对于底物abts，相对于野生型酶(seqidno:2)增加了1.4倍，比活性比hrpn175s高2倍。[0207]发现n175s取代能显著提高hrp的热稳定性。n175s单一取代能显著提高hrp的热稳定性，与突变的n-糖基化位点氨基酸n13d/n57s/n255d/n268d组合时，热稳定性更高，具有协同效应。单突变体p146q或单突变体n275k与n175s的组合导致稳定性略有下降；然而，当p146q和n275k与n175s组合时，还原作用减弱，表明p146q、n275k和n175s之间存在协同效应。[0208]n175s可以降低酶对几种底物的酶活性。然而，n13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(序列号：4)能抵消这种影响。因此，这种突变体为高热稳定性和最佳动力学性能的组合。当前第1页12当前第1页12

技术特征：

1.一种具有过氧化物酶活性的多肽，所述多肽包含与seq id no:3具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与seq id no:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述至少一个氨基酸取代为seq id no:1的氨基酸p146或氨基酸n275的取代。2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述至少一个氨基酸取代选自p146q、p146a、p146r、p146v、p146e、n275k、n275r、n275d、n275s、n275q、n275a和n275e；优选为p146q或n275k。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％、更优选至少99％的序列同一性；并且其中所述至少一个氨基酸取代选自p146q、p146a、p146r、p146v和p146e，优选为p146q。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优至少95％、更优选至少98％、更优选至少99％的序列同一性；其中所述至少一个氨基酸取代为p146q。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与seq id no:1相比包含选自p146q、p146a、p146r、p146v和p146e氨基酸取代，优选为p146q；和选自n275k、n275r、n275d、n275s、n275q、n275a和n275e氨基酸取代，优选为n275k。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与seq id no:1相比包含氨基酸取代p146q和n275k。7.根据权利要求1-6中任意一项所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％、更优选至少99％的序列同一性；最优选地，其中所述多肽的氨基酸序列为seq id no:3中所述的序列。8.根据权利要求1-7中任意一项所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与seq id no:1相比包含至少一个、优选至少两个、更优选至少三个、更优选至少四个、更优选至少五个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自n13d、n57s、n175s、n255d和n268d。9.根据权利要求1-8中任意一项所述的多肽，其中在ph 5和30℃下，在含有1mm h2o2的50mm柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中进行测定，所述多肽对底物3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(tmb)的过氧化物酶活性kcat/km值为至少0.01mm-1
s-1
，优选为至少0.1mm-1
s-1
，更优选为至少1mm-1
s-1
，更优选为至少10mm-1
s-1
，更优选为至少20mm-1
s-1
，更优选为至少100mm-1
s-1
，更优选为至少1000mm-1
s-1
，更优选为至少10000mm-1
s-1
，更优选为至少20000mm-1
s-1
。10.根据权利要求1-9中任意一项所述的多肽，其中包含所述氨基酸序列的多肽相对于包含seq id no:2中所述氨基酸序列的多肽具有更高的热稳定性。11.根据权利要求1-10中任意一项所述的多肽，其中在ph 5和30℃下，在含1mm h2o2的50mm柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中用7mmabts测定残余过氧化物酶活性，包含所述氨基酸序列的多肽在由20mm bistris/hcl ph 7、7％甘油和500mm nacl组成的缓冲液中在60℃下的半衰期为至少0.5小时、优选至少1小时、更优选至少2小时、更优选至少4小时、最优选至少6小时。12.一种核酸分子，包含如权利要求1-11中任意一项所述多肽的编码序列。13.一种包含如权利要求12所述核酸分子的表达载体。
14.一种包含如权利要求13所述表达载体的宿主细胞，优选其中所述宿主细胞是细菌，优选是大肠杆菌。15.一种如权利要求1-11任意一项所述多肽的制备方法，包括培养如权利要求14所述宿主细胞和回收所述多肽的步骤。16.一种包含根据权利要求1-11中任意一项所述多肽的组合物，优选包含一种或多种赋形剂。17.一种包含根据权利要求1-11中任意一项所述多肽的试剂盒，优选还包括选自缓冲液、试剂和说明书的组分。18.根据权利要求17所述的试剂盒，其进一步包括适于将所述多肽接合到另一蛋白质的交联剂。

技术总结

本发明提供了一种具有过氧化物酶活性的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述至少一个氨基酸取代为SEQ ID NO:1的氨基酸P146或氨基酸N275的取代。本发明还涉及一种核酸分子，其包含所述多肽的编码序列、包含所述核酸分子的表达载体和包含所述表达载体的宿主细胞。此外，提供了所述多肽的制备方法以及包含所述多肽的组合物和试剂盒。备方法以及包含所述多肽的组合物和试剂盒。