一种检测GJB2耳聋基因c.188delT突变位点的引物探针组合及方法与流程

一种检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的引物探针组合及方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的引物探针组合及方法。

背景技术：

2.听力障碍是人类常见的出生缺陷之一，耳聋病因复杂，60％以上与遗传因素有关。在耳聋基因变异携带者中，约70％的变异来自于gjb2、slc26a4、线粒体dna 12srrna及gjb3等4个热点基因。1997年gjb2首次被报道，发现其突变后与非综合征性听力丧失(nonsyndromic hearing loss，nshl)有密切关系，目前约50％的nshl由gjb2基因突变导致。gjb2属于常染体隐性遗传，定位于常染体13q11-12，dna全长为4804bp，编码区为678bp，是我国第一大致聋基因。该基因编码缝隙连接蛋白(connexin26)，connexin26蛋白与其它的连接蛋白分子形成连接子，其在毗邻的细胞融合形成缝隙连接通道，是细胞间电解质、第二信使和代谢物质的重要通路，对信息传递和物质交换起重要的作用。gjb2的突变导致耳蜗中主要的间隙连接异构体改变，导致非综合征性听力损失的发生。
3.随着研究的不断深入，越来越多的致病位点在gjb2上被发现，已发现gjb2有至少200种突变方式，出现在编码区的突变有至少106种，包括错义突变、缺失突变、剪切位点突变等。本技术的发明人首次发现，gjb2:c.188delt杂合突变与c.235delc形成复合杂合导致患者出现听力异常，c.188delt缺失导致gjb2基因移码突变，gjb2编码蛋白表达异常，是一种致病突变。
4.目前针对该突变主要可以采用sanger测序法及二代测序法，尚无针对gjb2:c.188delt位点的快速检测方法，测序技术成本相对较高，限制了该位点在人中大规模筛查。

技术实现要素：

5.本发明提供一种检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的引物探针组合及方法，用以解决现有技术中利用sanger测序法及二代测序法检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点成本高的缺陷，实现对gjb2耳聋基因c.188delt突变位点单独检测，以较低成本检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点。
6.本发明提供一种检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的组合物，包括以下引物和探针；
7.gjb2:c.188delt上游引物：5'-gagcaggccgactttgtctgc-3'；
8.gjb2:c.188delt下游引物：5'-tgatcttcgtgtccacgccagc-3'；
9.野生型探针：5'-aggctgcaagaacatgtgctac-3'；
10.突变型探针：5'-aggctgcaagaacagtgctac-3'。
11.根据本发明提供的一种检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的组合物，所述野
生型探针、突变型探针的5’端设有荧光基团，在3’端或距离5’端8-12个碱基的位置设有淬灭基团；
12.优选的，在3’端或距离5’端10个碱基的位置设有淬灭基团；
13.优选的，在距离5’端10个碱基的位置设有淬灭基团。
14.根据本发明提供的一种检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的组合物，所述野生型探针的荧光基团为fam、vic、rox、hex或cy5，标记在5’端，淬灭基团为bhq。
15.根据本发明提供的一种检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的组合物，所述突变型探针的荧光基团为fam、vic、rox、hex或cy5，淬灭基团为bhq。
16.本发明还提供一种检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的试剂盒，包括上述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的组合物；
17.优选的，还包括(nh4)2so4，更优选(nh4)2so4在pcr反应液中的终浓度为100～200μm。
18.根据本发明提供的一种检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的试剂盒，所述试剂盒中包括gjb2:c.188delt上游引物、gjb2:c.188delt下游引物、野生型探针、突变型探针、10
×
ex taq buffer、(nh4)2so4、dntps、ex taq hs、超纯水；
19.优选的，gjb2:c.188delt上游引物在pcr反应液中的终浓度为150～200nm、gjb2:c.188delt下游引物为150～200nm、野生型探针为150～200nm、突变型探针为150～200nm、(nh4)2so4为100～200μm、dntps为100～200μm。
20.本发明还提供一种检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的方法，针对待测样品，利用上述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的组合物或上述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的试剂盒进行实时荧光pcr检测，根据pcr检测结果判定基因型别；
21.优选的，所述待测样品为dna样本，pcr反应体系中，dna样本与pcr反应液的体积比为2:18；
22.优选的，用于检测的pcr反应程序为：95℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～15秒，60℃，30～60秒，5～10个循环；95℃，5～15秒，60℃，30～60秒，25～30个循环，收集荧光。
23.根据本发明提供的一种检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的方法，通过实时荧光pcr扩增，获得荧光信号的ct值，通过比较不同荧光信号的ct值，判断目标基因位点是否存在扩增，从而判断基因型别。
24.根据本发明提供的一种检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的方法，通过荧光信号的ct值和扩增曲线进行判断基因型别；
25.优选的，野生型探针荧光信号的ct值小于16，且有s型的扩增曲线，突变型ct值大于20，判定为野生型；野生型位点荧光信号的ct大于16，突变型ct值小于20，且有s型的扩增曲线，判定为纯合突变型；野生型和突变型荧光信号的ct值均小于20，且均有s型的扩增曲线，则判定为杂合突变型。
26.本发明还提供一种上述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的组合物、上述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的试剂盒在检测gjb2:c.188delt突变位点中的应用。
27.本发明的一个或多个实施例至少存在以下技术效果：
28.(1)本发明针对目的基因突变位点，设计通用性的上游引物、下游引物，以及两条不同荧光标记的特异性taqman探针，其在用于检测时具有很高的特异性，能有效地区分野
生型和突变型。
29.(2)本发明提供的检测gjb2:c.188delt突变位点的方法，通过荧光信号对基因型别进行判断，可以有效地区分野生型和突变型，可以对gjb2:c.188delt突变位点进行单独检测，成本较低，解决了现有技术中尚未有对该位点进行单独检测，利用sanger测序法及二代测序法检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点成本高的问题。
30.(3)本发明通过实时荧光pcr检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点，根据荧光信号的ct值和扩增曲线进行判断是野生型还是突变型，甚至可判断杂合突变型与纯合突变型。与现有技术相比，本发明提供了快速、准确和特异性高的检测gjb2:c.188delt突变位点的方法。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1为本发明实验例中临床样本的扩增曲线，该样本为野生型。
33.图2为本发明实验例中临床样本的扩增曲线，该样本为杂合突变型。
具体实施方式
34.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.本发明的目的是提供一种检测gjb2:c.188delt突变位点的方法，本发明针对检测位点设计野生和突变共用的上游引物和下游引物，以扩增目标突变位点所在的片段，同时再引入带有不同荧光标记信号的野生型探针和突变型探针，探针的荧光基团标记在5’端，探针的淬灭基团标记标记在距离5’端10个碱基的位置，通过pcr扩增，获得荧光信号的ct值，通过比较不同荧光信号的ct值，判断目标基因位点是否存在扩增，从而判断基因型别。
36.为了实现该目的，本发明以检测gjb2:c.188delt突变位点为例。技术方案如下：
37.本发明通过对gjb2:c.188delt突变位点所在的基因序列设计上游引物和下游引物，以获得突变位点所在的扩增片段，包括以下引物：
38.gjb2:c.188delt上游引物：5'-gagcaggccgactttgtctgc-3'
39.gjb2:c.188delt下游引物：5'-tgatcttcgtgtccacgccagc-3'
40.对gjb2:c.188delt位点分别设计带有不同荧光基团的野生型和突变型的taqman探针，包括以下探针：
41.野生型探针：5'-aggctgcaagaacatgtgctac-3'
42.突变型探针：5'-aggctgcaagaacagtgctac-3'
43.野生型探针的荧光基团为fam、vic、rox、hex或cy5等，标记在5’端，淬灭基团为bhq，标记在距离5’端10个碱基的位置。突变型探针的荧光基团为fam、vic、rox、hex或cy5
等，淬灭基团为bhq，标记在距离5’端10个碱基的位置。
44.使用上述引物、探针配制荧光pcr反应体系，pcr反应液中包括成分如下：
45.表1pcr反应液成分表
46.试剂名称浓度上游引物150～200nm下游引物150～200nm野生型探针150～200nm突变型探针150～200nm10
×
ex taq buffer1
×
(nh4)2so4100～200μmdntps100～200μmex taq hs1u超纯水补至总体为18μl
47.本发明设置的反应体系为20μl，pcr反应液为18μl，再加入2μl的dna样本。
48.用于检测的pcr反应程序为：95℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～15秒，60℃，30～60秒，5～10个循环；95℃，5～15秒，60℃，30～60秒，25～30个循环，收集荧光。
49.本发明的结果是根据荧光信号的ct值和扩增曲线进行判断。野生型探针荧光信号的ct值小于16，且有s型的扩增曲线，突变型ct值大于20，判定为野生型；野生型位点荧光信号的ct大于16，突变型ct值小于20，且有s型的扩增曲线，判定为纯合突变型；野生型和突变型荧光信号的ct值均小于20，且均有s型的扩增曲线，则判定为杂合突变型。
50.与现有技术相比，本发明提供了快速、准确和特异性高的检测gjb2:c.188delt突变位点的方法。
51.实施例1引物和探针的设计
52.本实施例通过分析gjb2:c.188delt突变位点的基因序列，利用引物设计软件primeprimer5.0，设计引物和探针，经过多轮筛选，并对探针进行改造，得到能够灵敏、准确的检测出目标位点的引物探针组合，具体序列如下：
53.上游引物：5'-gagcaggccgactttgtctgc-3'
54.下游引物：5'-tgatcttcgtgtccacgccagc-3'
55.野生型探针：5'-aggctgcaagaacatgtgctac-3'，5'端为荧光基团fam，淬灭基团为标记于距离5'端10个碱基的g上的bhq1。
56.突变型探针：5'-aggctgcaagaacagtgctac-3'，5'端为荧光基团vic，淬灭基团为标记于距离5'端10个碱基的g上的bhq1。
57.实施例2pcr反应体系的配制
58.本实施例提供了对pcr反应液的配制。具体的内容如下：
59.表2pcr反应液成分表
[0060][0061][0062]
实施例3pcr反应过程
[0063]
本实施例选用的样本为从人edta抗凝全血中提取的全基因组dna，其采用一般商业用核酸提取试剂盒提取，但为了保证扩增的准确性，不受到非dna物质的干扰，要求od
260/280
为1.8～2.0。
[0064]
本发明设置的反应体系为20μl，pcr反应液为18μl，再加入2μl的dna样本。用于检测的pcr反应程序为：95℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～15秒，60℃，30～60秒，5～10个循环；95℃，5～15秒，60℃，30～60秒，25～30个循环，收集荧光。
[0065]
实施例4结果的判定
[0066]
分别选取70例和3例，由二代测序得到的非gjb2:c.188delt位点突变和gjb2:c.188delt位点突变的患者样本，利用本发明方法进行扩增，得到野生型探针和突变型探针的荧光信号，利用roc曲线，对阳性判断值进行分析和确定。最终确定，当野生型信号的ct值小于16，突变型信号的ct值为无或者大于20时，该样本可判定为野生型；当野生型信号的ct值小于16，突变型信号的ct值小于20时，该样本可判定为杂合突变型；当野生型信号的ct值为无或者大于16，突变型信号的ct值小于20时，该样本可判定为纯合突变型。图1为本发明实验例中临床样本的扩增曲线，该样本为野生型。图2为本发明实验例中临床样本的扩增曲线，该样本为杂合突变型。
[0067]
试验例1在探针设计中，不同错配碱基的引入
[0068]
本发明中提供的探针序列，除了突变位点外，在突变位点前一位也引入了一个碱基的突变，在此试验例中将该位点引入不同的碱基，分析不同碱基的分辨能力，具体探针序列如下：
[0069]
表3不同错配碱基探针组合
[0070][0071]
除上述探针发生改变外，其余反应体系和反应程序均未发生变化。
[0072]
实验结果如下：
[0073]
表4不同错配碱基探针组合的检测结果
[0074]
[0075][0076]
上述实验结果中，只有组合3可以很好的区分野生型和突变型的样本，其余探针组合不能有效进行区分，故本发明选用组合3的探针序列。
[0077]
试验例2探针上标记在不同位置的淬灭基团
[0078]
本试验例中选用的探针淬灭基团为标记在距离5’端10个碱基位置的g碱基上，一般情况是将淬灭基团标记于探针的3’端。本试验例中对比了两种标记在不同位置的淬灭基团的探针，比较其扩增效果。反应体系配制、反应条件以及反应程序见实施例。具体检测结果如下：
[0079]
表5淬灭基团不同位置的探针检测结果
[0080][0081]
上述实验表明，淬灭基团标记在不同位置，都可以区分突变位点，但是标记在3’端的探针，在ct值上会有推迟的现象，除此之外，在荧光强度上，3’端标记的探针也会比标记在距离5’端10个碱基位置的探针弱一些，故此，本发明选用了淬灭基团标记在距离5’端10个碱基位置的探针。
[0082]
试验例3反应液中(nh4)2so4加入的比较
[0083]
在购买takara公司的ex taq hs时，会配有10
×
的ex pcr buffer，一般可满足实验的要求，不需要额外加入其它溶液。但在实验过程中发现，在体系中另外加入(nh4)2so4溶液后，可将ct值提前。
[0084]
具体的实验结果如下：
[0085]
表6在pcr反应液中加入(nh4)2so4溶液和不加入(nh4)2so4溶液的检测结果
[0086][0087]
上述结果中表明，在配制pcr反应液时，额外加入(nh4)2so4溶液，可使得ct值提前，这使得结果的判断更加的明确。
[0088]
试验例4与二代测序结果的比对
[0089]
本实验选用经过二代测序进行耳聋基因检测的50例样本，其中49例为gjb2:c.188delt位点野生型样本，1例为杂合突变。利用本发明方法对该50例样本进行得到的gjb2:c.188delt位点的检测，统计与二代测序结果的符合率，结果如下：
[0090]
表7临床样本结果
[0091]
[0092]
[0093][0094]
由上述结果可知，本发明检测结果与二代测序的结果符合率为100％，说明本发明方法的检测结果可靠。
[0095]
表8引物/探针序列
[0096][0097]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：

1.一种检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的组合物，其特征在于，包括以下引物和探针；gjb2:c.188delt上游引物：5'-gagcaggccgactttgtctgc-3'；gjb2:c.188delt下游引物：5'-tgatcttcgtgtccacgccagc-3'；野生型探针：5'-aggctgcaagaacatgtgctac-3'；突变型探针：5'-aggctgcaagaacagtgctac-3'。2.根据权利要求1所述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的组合物，其特征在于，所述野生型探针、突变型探针的5’端设有荧光基团，在3’端或距离5’端8～12个碱基的位置设有淬灭基团；优选的，在3’端或距离5’端10个碱基的位置设有淬灭基团；优选的，在距离5’端8～12个碱基的位置设有淬灭基团。3.根据权利要求2所述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的组合物，其特征在于，所述野生型探针的荧光基团为fam、vic、rox、hex或cy5，标记在5’端，淬灭基团为bhq。4.根据权利要求2所述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的组合物，其特征在于，所述突变型探针的荧光基团为fam、vic、rox、hex或cy5，淬灭基团为bhq。5.一种检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的组合物；优选的，还包括(nh4)2so4，更优选(nh4)2so4在pcr反应液中的终浓度为100～200μm。6.根据权利要求5所述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括gjb2:c.188delt上游引物、gjb2:c.188delt下游引物、野生型探针、突变型探针、10
×
ex taq buffer、(nh4)2so4、dntps、ex taq hs、超纯水；优选的，gjb2:c.188delt上游引物在pcr反应液中的终浓度为150～200nm、gjb2:c.188delt下游引物为150～200nm、野生型探针为150～200nm、突变型探针为150～200nm、(nh4)2so4为100～200μm、dntps为100～200μm。7.一种检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的方法，其特征在于，针对待测样品，利用权利要求1-4任一项所述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的组合物或权利要求5-6任一项所述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的试剂盒进行实时荧光pcr检测，根据pcr检测结果判定基因型别；优选的，所述待测样品为dna样本，pcr反应体系中，dna样本与pcr反应液的体积比为2:18；优选的，用于检测的pcr反应程序为：95℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～15秒，60℃，30～60秒，5～10个循环；95℃，5～15秒，60℃，30～60秒，25～30个循环，收集荧光。8.根据权利要求7所述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的方法，其特征在于，通过实时荧光pcr扩增，获得荧光信号的ct值，通过比较不同荧光信号的ct值，判断目标基因位点是否存在扩增，从而判断基因型别。9.根据权利要求7所述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的方法，其特征在于，通过荧光信号的ct值和扩增曲线进行判断基因型别；优选的，野生型探针荧光信号的ct值小于16，且有s型的扩增曲线，突变型ct值大于20，判定为野生型；野生型位点荧光信号的ct大于16，突变型ct值小于20，且有s型的扩增曲线，
判定为纯合突变型；野生型和突变型荧光信号的ct值均小于20，且均有s型的扩增曲线，则判定为杂合突变型。10.权利要求1-4任一项所述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的组合物、权利要求5-6任一项所述检测gjb2耳聋基因c.188delt突变位点的试剂盒在检测gjb2:c.188delt突变位点中的应用。

技术总结

本发明提供一种检测GJB2耳聋基因c.188delT突变位点的引物探针组合及方法。本发明检测GJB2耳聋基因c.188delT突变位点的组合物，包括以下引物和探针；GJB2:c.188delT上游引物：5'-GAGCAGGCCGACTTTGTCTGC-3'；GJB2:c.188delT下游引物：5'-TGATCTTCGTGTCCACGCCAGC-3'；野生型探针：5'-AGGCTGCAAGAACATGTGCTAC-3'；突变型探针：5'-AGGCTGCAAGAACAGTGCTAC-3'。本发明提供了快速、准确和特异性高的检测GJB2:c.188delT突变位点的方法。位点的方法。位点的方法。