(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510381235.4
(22)申请日 2015.07.02
C07K 14/415(2006.01)
C12N 15/29(2006.01)
A01H 5/00(2006.01)
(71)申请人中国农业科学院油料作物研究所
地址430062 湖北省武汉市武昌区徐东二路
2号
(72)发明人王汉中 华玮 刘静 胡志勇
杨红丽 张亮 王新发
(74)专利代理机构武汉宇晨专利事务所 42001
代理人龚莹莹 王敏锋
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种与油菜粒重相关基因
ARF18及其应用，本发明通过图位克隆的ARF18
基因能够控制油菜粒重，所述的ARF 基因序列为
SEQ ID NO.2所示。这对植物粒重调控的分子机 理研究将有极大的推动作用。本发明克隆的油菜
ARF18基因对油菜粒重有显著的调控作用，这对
阐明ARF18基因的生物学功能有重要意义。通过
基因工程技术提高或减弱ARF18基因的表达量能
的之间的平衡进而达到增产的目的。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书7页序列表4页 附图5页CN 106317211 A 2017.01.11
C N 106317211
A
1.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，所述的序列为SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的核苷酸序列在提高油菜粒重性状中的应用。
5.与权利要求1所述蛋白质同源的植物蛋白质序列在提高植物重性状中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，所述的植物为拟南芥。
一种与油菜粒重相关基因ARF18及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种与油菜粒重相关基因ARF18及其应用。
背景技术
[0002] 随着人口的快速增长，全球食物短缺问题变得越来越严重。因此，在作物产量方面急需突破。作为影响作物产量的三因素之一，粒重已经被广泛认为是多基因控制的复杂数量性状。对粒重性状的遗传和分子机制的解析对于提高作物育种效率非常重要。[0003] 种子大小受到一系列细胞过程的影响。这种影响来源于双亲效应和母体/合子组织(Fang et al.,2012)。在模式植物拟南芥中，一些突变体如ap2、arf2、da1、eod3、ttg2、klu等主要通过调控种皮的细胞延伸来控制种子大小(Fang et al.,2012；Ohto et al.,2005；Schruff et al.,2006；Garcia et al.,2005；Adamski et al.,2009)，而在mini3、iku1、iku2和shb1突变体中，胚乳在种子发育早期过早细胞化或增值影响了种子大小(Garcia et al.,2003；Luo et al.,2005；Wang et al.,2010；Zhou et al.,2009；Kang et al.,2013).met1基因由于CG背景中胞嘧啶残基甲基化的缺失导致对种子大小具有双亲效应(Feng et al.,2010)。在水稻中，已鉴定出47个籽粒长度QTLs和48个籽粒宽度QTLs(Bao,2014)，一些调控籽粒大小的基因如GW2、GIF1、qSW5、GS3、GS5、GW
8和qGL3被定位(Song et al.,2007；Wang et al.,2008；Shomura et al.,2008；Weng et al.,2008；Mao et al.,2010；Li et al.,2011；Wang et al.,2012；Zhang et al.,2012)。其中，GW2和qSW5通过调节外颖壳细胞数目影响粒重，而其它基因则是直接调节籽粒细胞数目或细胞大小来影响粒重。尽管粒重研究取得不错进展，目前在多倍体油菜中仍没有发现调控粒重的新基因。
[0004] 多倍体是由单倍体多倍化或者两个或更多多样性基因组的组合，后者是在开花植物包括许多重要农作物中普遍存在的(Masterson,1994)。多倍体基因组由于不同染体上同源序列的存在和同源基因的互作使得QTL定位更加困难。如甘蓝型油菜(AACC)，世界上继大豆之后的第二大油料作物，是由白菜和甘蓝两个祖先种自然杂交而来。白菜为A基因组。A基因组与甘蓝的C基因组相似度非常高(Rana et al.,2004)。最近几年，作为全球重要的农业作物，油菜受到越来越多的关注。目前为止，尽管有80多个粒重相关的QTL被鉴定出来，具体调控基因尚未见报道(Quijada et al.,2006；Udall et al.,2006；Fan et al.,2010；Yang et al.,2012)。
[0005] 我们前期的研究中，利用zy72360和R1构建的F2分离体检测到一个位于A9染体上的粒重主效QTL，其贡献率超过30％。在本发明中，我们通过构建近等基因系和资源体关联分析图位克隆了A9位点的粒重调控基因。其中，ARF18作为调控粒重的候选基因，利 用模式植物拟南芥和油菜作了进一步的功能分析。
发明内容
[0006] 本发明的目的是在于提供了一种与油菜粒重相关基因ARF18，其序列为SEQ ID NO：2所示。编码的蛋白质为SEQ ID NO.3所示。
[0007] 本发明的另一个目的是在于提供了一种与油菜粒重相关基因ARF18在提高植物粒重性状中的应用。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术措施：
[0009] 一种与油菜粒重相关基因ARF18，通过以下方式得到：
[0010] 1.粒重主效QTL位点的近等基因系构建
[0011] 亲本zy72360和R1在粒重性状方面具有显著差异。通过F2体对粒重性状QTL 进行初定位。利用F1和亲本连续回交4次，期间利用QTL连锁标记结合表型进行遗传前景的选择，同时利用非连锁标记进行遗传背景的评估，从BC4F1体中获得目标QTL杂合且遗传背景回复率高的QTL-NIL单株；利用BC4F1代杂合目标QTL-NIL单株自交获得BC4F2代QTL-NIL分离体。
[0012] 2.粒重主效QTL位点的精细定位
[0013] 基于该区间新开发的引物，我们利用近等基因系BC4F2体缩短区间。根据区间内的SNP信息，
通过PCR扩增继续缩短区间.为了进一步缩短QTL区间的距离，利用380份资源体，开发并筛选获得区间内的标记引物进行粒重表型和基因型之间的关联分析。根据连锁分析和关联分析，我们最终将该区间定位至50kb以内并在该区域内发现7个基因。[0014] 3.确定突变位点，获得候选基因
[0015] 根据油菜基因组序列，我们利用zy72360和R1材料克隆了上述7个基因的编码区和上游调控区，序列对比发现其中4个基因存在SNP和In/Del。其中ARF18基因的变异最大，将其列为调控粒重主效QTL位点的候选基因。
[0016] 4.ARF18基因的功能验证
[0017] 利用模式植物拟南芥为受体，超量表达ARF18及其等位基因验证其功能。构建超表达载体，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入拟南芥中，最后每个基因获得超表达的转基因株系约30株。获得转基因材料的纯合株系，考察粒重表型，最终发现ARF18(SEQ ID NO.2所示)的过量表达可以降低种子重量。通过对该基因的拟南芥同源基因突变体表型的调查，发现突变体材料的种子粒重增加。这表明ARF18的表达水平高低可以调控植物种子的重量。
[0018] 最终获得了一种与油菜粒重相关基因ARF18，其序列为SEQ ID NO.2所示。[0019] 一种与油菜粒重相关基因ARF18在提高油菜粒重性状中的应用，包括通过生物技术，将油菜中ARF18基因的表达进行抑制，获得的转基因植物的种子粒重增加。
[0020] 本发明的保护内容还包括，与SEQ ID NO.3所示蛋白质同源的植物蛋白质在提高植物粒重性状中的应用，即将植物中与SEQ ID NO.3所示蛋白质同源的植物蛋白质的表达进行抑制，获得的转基因植物的种子粒重增加。
[0021] 本发明中所用的术语“转基因植物”是指含有导入的基因并能够稳定地增强或抑制所导入的基因表达并产生具有特定的生物学性状的植物。本发明中所提到的植物包括水稻、小麦、玉米等粮食作物，也包括油菜、大豆、棉花等经济作物，还包括夏季生长的黄瓜、番茄等蔬菜作物，还包括拟南芥。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0023] 目前油菜中尚未定位到粒重调控相关基因，本发明通过图位克隆的ARF18基因能够控制油菜粒重，这对植物粒重调控的分子机理研究将有极大的推动作用。虽然在拟南芥中ARF18的基因序列已被公开，但并不清楚其具体的生物学功能，本发明克隆的油菜ARF18基因对油菜粒重有显著的调控作用，这对阐明ARF18基因的生物学功能有重要意义。通过基因工程技术提高或减弱ARF18基因的表达量能够调控油菜种子的大小，从而有利于产量三因素的之间的平衡进而达到增产的目的。
附图说明
[0024] 图1两亲本zy72360和R1的粒重表型分析。
[0025] 图2近等基因系连锁分析将粒重QTL区间缩短至120kb。
[0026] 图3资源体关联分析发现该QTL区间部分标记与粒重性状极显著相关。[0027] 图4 zy72360和R1材料中ARF18基因的序列差异比较。
[0028] 图5来自R1材料中的ARF18在拟南芥中的过量表达降低种子重量，而来自zy72360中的基因过量表达没有导致种子发生显著改变。
[0029] 图6拟南芥ARF18突变体种子重量增加。
[0030] 图7 ARF18RNAi的表达载体转化R1导致转基因株系的种子粒重增加。
具体实施方式
[0031] 通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)，或Draper等人(Blackwell科学出版社,1988)所述的条件，或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。
[0032] 实施例1：
[0033] 粒重主效QTL位点的近等基因系构建
[0034] 亲本甘蓝型油菜zy72360和R1(Hu Z,Hua W,Huang S,Yang H,Zhan G,Wang X,et al.(2012)Discovery of Pod Shatter-Resistant Associated SNPs by Deep Sequen cing of a Representative Library Followed by Bulk Segregant Analysis in Rapesee
d.PLoS ONE 7(4):e34253.)在粒重性状方面具有显著差异(zy72360为5.53±0.43g，R1为
3.98±0.51g)(图1)。首先，我们通过F2体将SW QTL定位到W236和W239之间。利用F1和亲本连续回交4次，期间利用QTL连锁标记结合表型进行遗传前景的选择，同时利用非连锁标记进行遗传背景的评估，从BC4F1体中获得目标QTL杂合且遗传背景回复率高的QTL-NIL单株；利用BC4F1代杂合目标QTL-NIL单株自交获得BC4F2代QTL-NIL分离体。田间种植该体，最终获得3800个单株。
[0035] 实施例2：粒重主效QTL位点的精细定位
[0036] 基于该区间新开发的引物，我们利用近等基因系BC4F2体，将该区间缩短至W024和W004之间的147kb。利用147kb以内的SNP信息，通过PCR扩增将区间继续缩短至120kb(图2).为了进一步缩短QTL区间的距离，利用380份资源体，开发并筛选获得11个QTL区间内的标记引物进行粒重表型和基因型之间的关联分析。结果显示位于SSR-72and SSR-89之间的标记显示显著的关联性(图3)。根据连锁分析和关联分析，我们最终将该区间定位至50kb以内。
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